唐 曦 唐成林 劉仁建

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016)

絕經(jīng)后婦女用雌激素替代治療可提高絕經(jīng)后婦女的認(rèn)知和記憶能力〔1〕。膽堿能系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，其作用以興奮為主，廣泛影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，其中包括在促進學(xué)習(xí)和記憶方面所起的重要作用，且與海馬的膽堿能系統(tǒng)直接相關(guān)〔2〕。 在臨床上，針灸對治療老年婦女認(rèn)知功能障礙有一定的療效，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用卵巢切除大鼠模型，造成低雌激素記憶障礙，觀察電針對去卵巢大鼠行為學(xué)，體內(nèi)雌激素水平及海馬乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(CHAT)生成的影響，探討電針改善絕經(jīng)后婦女認(rèn)知功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組、模型制備 健康雌性SD大鼠40只，3月齡，體重160～200 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，合格證號: SCXK(瀘)2007-0005。 采用隨機數(shù)字法將大鼠隨機分成假手術(shù)組；模型組；電針組；假電針組，每組10只。10%水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)按0.3 ml/100 g，腹腔注射麻醉。假手術(shù)組切除卵巢周圍(DOX)脂肪，其余各組均實行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。假手術(shù)組和模型組術(shù)后不予任何處理；電針組切除卵巢2 w后予電針刺激，選穴方法按華興邦氏的方法實施，選取“足三里”“腎俞”兩穴，在不麻醉的狀態(tài)下采用一次性細美容針刺入穴位，雙側(cè)足三里穴接通韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，刺激參數(shù)：連續(xù)脈沖波，頻率3～4 Hz，強度4～5 mA，以使大鼠后肢抖動為宜，在上午9時開始，每次20 min，隔日1次，連續(xù)治療3個月；假電針組針刺操作同電針組，但不接通電針儀。水迷宮測試結(jié)束后，將大鼠麻醉,頸總動脈取血，分離血清。在冰面上斷頭取腦，并迅速分離海馬組織，立即將海馬組織置液氮中，于-80℃低溫冰箱保存，用于組織蛋白和組織mRNA的提取。

1.2Morris水迷宮測試 于造模前后、治療后進行測試。

1.2.1定位航行試驗 歷時4 d，每天上下午各2次，將大鼠面向池壁，分別從4個入水點放入池中，記錄大鼠尋找到并爬上平臺所需時間即為逃避潛伏期時間。

1.2.2空間探索試驗 定位航行試驗后,去除平臺，將大鼠任選一個入水點將大鼠放入池中，測定其在120s內(nèi)跨越平臺位置的次數(shù)。

1.3競爭性抑制酶免疫分析法(ELISA) 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓實自封條，密封口袋，放回4℃?？瞻卓准訕?biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μl/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90 min。提前前20 min準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。 洗板5次?？瞻卓准由锼鼗贵w稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60 min。提前前20 min準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22℃～25℃)放置。洗板5次?？瞻卓准用附Y(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 μl/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30 min。打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。洗板5次。加入顯色底物100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15 min。加入終止液100 μl/孔,混勻后即刻測量450 nm下外直徑(OD)值(3 min內(nèi))。

1.4Western 印跡 從-80℃低溫冰箱中取出大鼠海馬組織，加入400 μl裂解液 勻漿后，充分裂解。離心10 min。將上清分裝，存于-70℃?zhèn)錂z。牛血清白蛋白(BSA)50 mg，加雙蒸水到50 ml,配置成終濃度為1 g/L的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮藍G250染液990 ml，測定595 nm OD值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求所得濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為70 μg，并于95℃～100℃ 5 min后冰上冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V約30 min，分離膠100 V約90 min。取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min。準(zhǔn)備濾紙及NC膜，分別置入轉(zhuǎn)移緩沖液及去離子水中。平放底部電極(陽極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200 mA通電，電轉(zhuǎn)移100 min。PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉(4℃，過夜)，棄去封閉液，不洗。按約0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體CHAT(1∶400 Santa Cruz)搖床搖蕩孵育(4℃，過夜)。PBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記抗體)，二抗用封閉液稀釋(1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。按0.1 ml/cm2顯影液計算用量，將顯影液加于PVDF膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調(diào)整曝光時間，直至出現(xiàn)最佳條帶。應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)掃描定量， 對各特異性蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參條帶進行灰度掃描，以兩者比值作為該蛋白合成的相對量。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮法行為學(xué)檢測結(jié)果 造模前,各組逃避潛伏期時間及跨越平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)，說明造模前大鼠的認(rèn)知條件相同；造模后，模型組、假電針組、電針組與造模前比較，大鼠逃避潛伏期時間明顯延長，跨越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)，說明大鼠去卵巢后雌激素水平降低，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減低；電針治療后，電針組逃避潛伏期時間明顯縮短，跨越平臺次數(shù)明顯增加，與治療前及模型組有顯著差異(P<0.05)，與假手術(shù)組無顯著性差異(P>0.05)。假電針組雖有改善，但仍與假手術(shù)組、電針組之間有顯著性差異(P<0.05)，說明電針能夠提高去卵巢大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，逆轉(zhuǎn)記憶損傷。見表1、表2。

2.2電針對去卵巢大鼠血清E2的影響 治療后3個月，模型組大鼠血清E2水平較假手術(shù)組顯著下降〔(56.47±6.70) pg/ml,P<0.01〕，電針組血清E2水平較模型組明顯上升〔(38.16±5.44) pg/ml,P<0.05〕，但仍未達到假手術(shù)組水平〔(65.13±7.72)pg/ml，P<0.01〕，假電針組雖血清E2水平(49.29±5.90)pg/ml較模型組有所上升，但仍與假手術(shù)組、電針組之間有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果表明電針能夠提高血清E2的水平。

表1 各組大鼠 Morris 水迷宮逃避潛伏期測試成績比較

表2 各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺數(shù)測試成績比較

2.3電針對去卵巢大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白的影響 與假手術(shù)組(0.62±0.40)比較，模型組大鼠海馬CHAT蛋白表達顯著降低(0.33±0.06,P<0.01)，與模型組比較，電針組CHAT蛋白表達顯著升高(0.50±0.05，P<0.01)，但仍未達到假手術(shù)組水平(P>0.05)。假電針組蛋白表達雖略有升高(0.37±0.42)，但與模型組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明電針能夠上調(diào)去卵巢大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白表達。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CHAT蛋白表達

3 討 論

本實驗采用去卵巢大鼠動物模型，造成低雌激素記憶障礙。OVX是一種較好的制備雌激素缺乏模型方法〔3〕。去卵巢大鼠模型不僅有類似絕經(jīng)婦女雌激素水平的變化和全身多系統(tǒng)衰老的表現(xiàn)，該模型還表現(xiàn)為基底前腦膽堿能系統(tǒng)及海馬突觸功能降低，而且出現(xiàn)相應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔4〕，是一種較好的研究絕經(jīng)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的模型，已被廣泛用于觀察體內(nèi)雌激素減少對機體功能活動影響的實驗中。Luine〔5〕等研究表明大鼠OVX可使其學(xué)習(xí)、記憶功能明顯下降，并出現(xiàn)海馬CHAT 活性明顯降低。故本實驗采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備雌激素缺乏模型，觀察海馬CHAT蛋白表達水平的變化。

Morris水迷宮測試是目前廣泛使用的一種評估嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的方法〔6〕。本實驗利用 Morris 水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗檢測去卵巢大鼠行為學(xué)改變及電針對學(xué)習(xí)記憶的影響。研究結(jié)果表明去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。電針組與假電針組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，且電針組改變更明顯。說明從行為學(xué)角度評價，電針可改善去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

大腦海馬結(jié)構(gòu)是參與學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)核團，與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，是記憶儲存場所，海馬腦區(qū)的正常結(jié)構(gòu)是維持動物正常神經(jīng)行為功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也是衰老性變化出現(xiàn)早且最顯著的腦區(qū)之一，海馬結(jié)構(gòu)的損傷可造成學(xué)習(xí)記憶功能障礙。海馬膽堿能系統(tǒng)的興奮是學(xué)習(xí)、記憶、意識的基礎(chǔ)。大量的研究已經(jīng)明確證實記憶功能高度依賴于膽堿能系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。Bartus等〔7〕著名的“老年記憶障礙的膽堿能假說”認(rèn)為腦組織中膽堿能神經(jīng)元的功能失調(diào)在實質(zhì)上導(dǎo)致了一些老年個體和AD病人認(rèn)知功能的降低。乙酞膽堿是和學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，海馬的膽堿能神經(jīng)元活動與學(xué)習(xí)、記憶有密切關(guān)系〔8〕。中樞膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用，海馬直接參與信息的貯存和回憶，且予海馬膽堿能系統(tǒng)由直接關(guān)系〔9〕。以乙酞膽堿為神經(jīng)遞質(zhì)的中樞膽堿能神經(jīng)是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，其正常功能是學(xué)習(xí)、記憶的必要條件。膽堿乙酰化轉(zhuǎn)移酶是乙酰膽堿合成的關(guān)鍵酶，是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能變化的重要標(biāo)記〔10〕。Singh等〔11〕報道，OVX 導(dǎo)致大鼠回避反應(yīng)減少和空間記憶減退，其大腦皮質(zhì)和海馬對合成 Ach 的原料膽堿的高親合力攝取減少，CHAT 活性降低。中樞膽堿能系統(tǒng)受神經(jīng)營養(yǎng)因子和雌激素的雙重調(diào)節(jié)〔12〕，雌激素的長期缺乏影響膽堿能神經(jīng)元的生長與存活。

本研究觀察說明電針能提高體內(nèi)雌激素水平，并且CHAT蛋白表達受體內(nèi)雌激素水平變化的影響，提示老年婦女認(rèn)知功能的減退與體內(nèi)雌激素水平和海馬CHAT蛋白表達降低有關(guān)。有研究已表明針刺可維持衰老時腦內(nèi)乙酞膽堿的含量，并調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)的功能活動〔13〕，改善學(xué)習(xí)記憶功能。針刺可使老化小鼠膽堿酯酶的活性降低，海馬及紋狀體內(nèi)乙酞膽堿含量增加〔14〕。與本研究結(jié)果一致。本研究表明，電針對大鼠腦海馬CHAT蛋白表達有調(diào)整作用，故電針可能通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)CHAT的表達，促進膽堿能神經(jīng)元的存活、分化、再生,從而減輕受損腦組織的病理改變,提高雌激素缺乏去卵巢模型大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，為電針用于臨床治療癡呆類等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變提供理論依據(jù)。電針影響學(xué)習(xí)記憶的作用機制是多方面的，這可能和電針使體內(nèi)雌激素的水平升高從而上調(diào)海馬CHAT表達有關(guān)，也可能和電針對神經(jīng)內(nèi)分泌的整體調(diào)節(jié)有密切關(guān)系，電針也可通過影響腦內(nèi)某些神經(jīng)遞質(zhì)如內(nèi)腓肽、P物質(zhì)NPY等調(diào)節(jié)雌激素受體的表達〔15〕。因此電針在改善學(xué)習(xí)記憶功能和治療老年癡呆癥的作用途徑亦可能是很復(fù)雜的，更深入的作用機制尚需進一步研究。

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