蔡 輝

(婁底市中心醫(yī)院老年科，湖南 婁底 417000)

原發(fā)性高血壓(EH)是多基因疾病。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在血壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用。編碼這個(gè)系統(tǒng)的基因的分子變異與一些心血管疾病密切相關(guān)，有報(bào)道其中的醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的多態(tài)性-344C/T與EH、左心室肥厚、小動(dòng)脈順應(yīng)性有關(guān)〔1〕。該基因?qū)儆诩?xì)胞色素氧化酶(CYP)基因超家族，精確定位于染色體8q24.3，它含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，與類固醇羥化酶(CYP11B1)基因具有高度同源性，核苷酸序列90%以上相同。位于該基因上的一些點(diǎn)突變可以引起醛固酮合成減少，而該基因啟動(dòng)子區(qū)-344C/T多態(tài)性與原發(fā)醛固酮增多癥相關(guān)〔2〕。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心(NCBI)的核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道了CYP11B2基因的11個(gè)錯(cuò)義SNPs和位于其他部位的 95個(gè)SNPs，數(shù)據(jù)主要由歐美人提交，不同人種SNP分布不同。本研究旨在尋找中國(guó)漢族人群中CYP11B2基因編碼區(qū)序列的多態(tài)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 31例血壓正常人，年齡40～60歲，收縮壓<135 mmHg，舒張壓<85 mmHg。32例EH病人，年齡40～60歲，收縮壓>140 mmHg和(或)舒張壓>90 mmHg，排除繼發(fā)高血壓等。24例初步診斷原發(fā)醛固酮增多患者，血漿醛固酮與血漿腎素活性的比值(ARR)>50，血漿醛固酮的水平>正常參考值〔(5.79～17.39)ng/dl〕，排除繼發(fā)醛固酮增多癥。

1.2相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 ①血壓測(cè)定：采用標(biāo)準(zhǔn)袖帶臺(tái)式血壓儀，按照標(biāo)準(zhǔn)血壓測(cè)定方法讀取血壓值，以Krotokof第1音為收縮壓，第5音為舒張壓，每間隔2 min測(cè)量1次，共測(cè)量3次取平均值。②血漿腎素活性與血漿醛固酮的測(cè)定采用放射免疫法(RIA)，醛固酮放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3基因組DNA提取 常規(guī)酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度后，標(biāo)化DNA濃度為200～300 ng/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì) 利用Primer 5.0和oligo6.0軟件，以NCBI中的序列(D13752)為參考，針對(duì)CYP11B2的外顯子和內(nèi)含子交界處設(shè)計(jì)引物，引物由北京奧科公司合成。PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自大連寶生物公司。見(jiàn)表1。

表1 CYP11B2各對(duì)引物序列

1.5PCR擴(kuò)增 50 μl反應(yīng)體系包含：10×PCR 緩沖液5 μl，2.5 mmol/L MgCl24 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，10 μmol/L上游引物1 μl，10 μmol/L下游引物1 μl，DNA 200～300 ng，Taq酶 0.5 U，消毒去離子水補(bǔ)充至50 μl。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃30 s，退火及延伸條件見(jiàn)表2，共32個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并將目的條帶割下。

1.6產(chǎn)物回收及測(cè)序 按照晶美生物公司的DNA Extraction Kit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的片段的純化回收。將回收產(chǎn)物送往北京奧科公司，以PCR引物為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。

1.7SNP的篩選 采用Blast，DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。

表2 各對(duì)引物的退火溫度及延伸時(shí)間

1.8統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)所發(fā)現(xiàn)的SNPs數(shù)目及各SNP特征，計(jì)算每個(gè)SNP的基因型頻率和等位基因頻率，與GenBank上公布的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。再通過(guò)在線 (http：//pga.gs.washington.edu/VG2.html)，EMLD軟件和Haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，并通過(guò)在線 (http：//pga.gs.washington.edu/VH2.html)和PHASE2.0進(jìn)行單體型構(gòu)建。組間基因型和等位基因分布及單體型頻率差異均采用SPSS12.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1所檢測(cè)區(qū)域的SNPs概況 經(jīng)CYP11B2基因全部外顯子和部分內(nèi)含子的序列擴(kuò)增并測(cè)序，總計(jì)檢測(cè)到序列為4 580 bp，發(fā)現(xiàn)18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，有6個(gè)SNPs，位點(diǎn)在國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道，占33%。有一個(gè)有意義位點(diǎn)，G5821A。其余的為同義突變或者位于內(nèi)含子區(qū)。見(jiàn)表3。

表3 CYP11B2基因SNPs情況

1)此處SNP位置參考GenBank上的序列(D13752)；435G/S：435甘氨酸/絲氨酸；rs編號(hào)為NCBI中dbSNP庫(kù)中的號(hào)碼，顯示突變位點(diǎn)(下劃線處)兩側(cè)鄰近10個(gè)堿基序列

2.2SNPs頻率分布和類型 在18個(gè)SNPs中，根據(jù)同一位點(diǎn)次要基因頻率，將其分為低頻(<0.05)，其中SNPs為 5個(gè)；中頻(0.05～0.15)，SNPs為6 個(gè)；高頻(>0.15)，SNPs為7 個(gè)。各組間SNP等位基因頻率和基因型頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3部分SNPs在不同人種中的分布 見(jiàn)表4。

2.4CYP11B2外顯子和部分內(nèi)含子測(cè)序圖 黑色箭頭為突變位點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.5連鎖不平衡分析和單體型構(gòu)建 通過(guò)對(duì)這些SNPs位點(diǎn)進(jìn)行在線連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)其中位點(diǎn)1205與1441，3497與3499和3803，3868與3881，存在完全連鎖不平衡，r2=1；位點(diǎn)4918與5160存在較強(qiáng)連鎖，r2=0.9，見(jiàn)圖3和表5。對(duì)其中的9個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析。其中7種單體型占85.4%，頻率均大于2%，分別為56%，10.8%，4.8%，3.6%，3%，2.4%。

圖1 可視化基因型分布圖

圖2 CYP11B2外顯子及部分內(nèi)含子基因測(cè)序圖

圖3 連鎖不平衡分析圖

表4 CYP11B2基因部分SNPs次要等位基因在不同人種中的分布

另外通過(guò)PHASE2.0軟件進(jìn)行精確的單倍體構(gòu)建，結(jié)果與上述在線分析一致。兩種主要單體型111111111111和111101111111的頻率在三組中均大于10%，能解釋69%、64%、75%的個(gè)體。在單體型110111111111中原發(fā)醛固酮增多癥組和另外兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；111100000111在原發(fā)醛固酮增多癥組中占5%，而在另外兩組中不存在。見(jiàn)表6。

表5 兩位點(diǎn)間連鎖不平衡分析(通過(guò)EMLD軟件)

表6 12個(gè)SNP位點(diǎn)組成的7種主要單體型(通過(guò)PHASE2.0軟件)

3 討 論

第三代遺傳標(biāo)記單鏈SNP是人類基因組DNA序列中最常見(jiàn)的變異形式，這種多態(tài)性包括單個(gè)堿基的缺失和插入以及單個(gè)堿基的置換。SNP為一種二等位基因變異，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換與顛換之比為2∶1，在GC序列出現(xiàn)最頻繁。SNP分布不均勻，由于選擇壓力等原因，絕大多數(shù)SNPs位于非轉(zhuǎn)錄序列。SNP其意義與位置有關(guān)：調(diào)控區(qū)SNP可能影響蛋白表達(dá)的水平，編碼區(qū)SNP可能導(dǎo)致氨基酸殘基改變，這兩種SNP都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變〔3〕。

人醛固酮合成酶主要位于腎上腺皮質(zhì)球狀帶，它能催化脫氧皮質(zhì)酮變成皮質(zhì)酮，另外它還具有18-羥化酶活性和18-氧化酶活性，分別催化皮質(zhì)酮變?yōu)?8-羥化皮質(zhì)酮和催化18-羥化皮質(zhì)酮變?yōu)槿┕掏?。其編碼基因CYP11B2基因含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，與CYP11B1基因相隔40 kb，兩者具有高度同源性，編碼區(qū)序列同源性為95%，內(nèi)含子序列同源性為90%，蛋白質(zhì)相似性為93%。兩者都編碼503個(gè)氨基酸殘基，分子量分別為48.5 kD和50 kD。為了能夠保證特異性擴(kuò)增出CYP11B2的外顯子，而不是CYP11B1，首先通過(guò)Blast(www.ncbi.nlm.gov/blast)仔細(xì)比對(duì)這兩個(gè)序列的各個(gè)外顯子和內(nèi)含子，然后在差異明顯處設(shè)計(jì)引物的3′末端。

通過(guò)對(duì)CYP11B2基因9個(gè)外顯子和部分內(nèi)含子序列測(cè)序，將結(jié)果與已知的SNP信息進(jìn)行比較，確定CYP11B2基因SNP在中國(guó)漢族人群中分布的具體位點(diǎn)和類型：總共檢測(cè)出18個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，14個(gè)為轉(zhuǎn)換，即嘌呤變成嘌呤，嘧啶變成嘧啶。4個(gè)位于編碼區(qū)，其中3個(gè)為同義突變，分別位于第37、374、390個(gè)氨基酸處，變異頻率分別為22%，11.7%，1%，GenBank上登錄的rs編號(hào)分別為rs5281，rs4538，rs5313。同義改變不會(huì)改變氨基酸但可能會(huì)改變剪切部位而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。1個(gè)為錯(cuò)義突變，位于第435個(gè)氨基酸處，由甘氨酸變成絲氨酸，變異頻率為23%，rs編號(hào)為rs4545。已有研究發(fā)現(xiàn)在一例原發(fā)醛固酮合成減少(皮質(zhì)酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏)的病人DNA序列中存在該變異，體外蛋白質(zhì)功能研究表明該突變可以導(dǎo)致18-羥化酶活性和18-氧化酶活性受損〔4〕。而本次研究中，這個(gè)變異在高血壓組中發(fā)現(xiàn)，此病人該處的變異為一雜合突變，并且在整個(gè)測(cè)序區(qū)段中只發(fā)現(xiàn)這一個(gè)變異，其他17個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均未檢測(cè)到，而該病人的腎素、醛固酮水平正常。此現(xiàn)象似乎與上述研究結(jié)果有矛盾之處，但上述皮質(zhì)酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏的病人的基因變異為純合突變，考慮為基因劑量效應(yīng)的影響。

剩下的14個(gè)變異均位于內(nèi)含子區(qū)，有6個(gè)未見(jiàn)國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道，分別是G949A，A1441G，T1457C，T4880C，T4881G，C5264T。次要等位基因頻率分別為43%，14.6%，1%，22%，22%，2.1%。C1205T國(guó)外SNP數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)登錄，但Nicod等〔5〕在6個(gè)糖皮質(zhì)激素抑制的醛固酮增多癥(GRA)病人中檢測(cè)到有5個(gè)病人存在這個(gè)變異，因此認(rèn)為該變異是一種多態(tài)。其余7個(gè)在國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)中有報(bào)道，rs4538在中國(guó)漢族人群中的次要等位基因頻率為11.7%，而在國(guó)外2種人群中頻率為25%和32.5%。rs4545在中國(guó)北京人和日本人群中A等位基因頻率分別為53.3%和46.6%，而在歐洲和非洲人群中分別為1.7%和2.5%，這表明該位點(diǎn)在亞洲黃種人群中的分布類型與歐美白人和非洲黑人相比存在很大的差異。rs5281次要等位基因A頻率為2.2%，與國(guó)外報(bào)道的2.5%基本一致。rs5313次要等位基因A頻率為1%，而在國(guó)外人群中為15%，推測(cè)可能與樣本量較少有關(guān)，也有可能是種族差異所致。rs6399，rs6418次要等位基因T頻率均為22.7%，國(guó)外人群為均32.5%。rs6434，rs10110732，rs13252628，rs28531895，rs36018151國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)頻率報(bào)道。據(jù)中國(guó)少數(shù)漢族人群樣本數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)漢族人群的SNP分布特點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道的不盡一致，充分說(shuō)明SNP存在種族遺傳性和地區(qū)遺傳性。

Gordon〔6〕對(duì)腎上腺皮質(zhì)腺瘤(APA)做了很深入的基因分析，報(bào)道了在腎上腺皮質(zhì)瘤組織里腎素的mRNA水平增加，但編碼腎素，AT1受體，P53的基因均未找到突變。Yoshiyu等〔7，8〕在APA病人體內(nèi)也沒(méi)找到突變。Jaresch等〔9〕研究了APA病人體內(nèi)醛固酮分泌增多是否由CYP11B1基因突變引起，但他們未發(fā)現(xiàn)突變。21-羥化酶缺乏參與了腎上腺皮質(zhì)腫瘤的形成〔10〕，Beuschlein等〔11〕研究了21-羥化酶的編碼基因CYP21的mRNA變化，發(fā)現(xiàn)mRNA顯著增高和一個(gè)突變點(diǎn)Val281Leu，但這個(gè)變異被認(rèn)為是個(gè)多態(tài)性。同樣，他們對(duì)特發(fā)型醛固酮增多癥(IHA)病人的CYP11B2基因編碼區(qū)測(cè)序也未能找到突變。本研究也未在中國(guó)原發(fā)醛固酮增多病人中找到有意義的突變。這些結(jié)果提示了CYP11B2基因的某些調(diào)控因素比如未確定的刺激醛固酮生成物質(zhì)或者是基因啟動(dòng)子區(qū)的異常導(dǎo)致了CYP11B2 mRNA過(guò)量表達(dá)。

連鎖不平衡分析表明有9個(gè)SNPs存在較強(qiáng)或者完全連鎖不平衡現(xiàn)象，單體型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)1種單體型在原發(fā)醛固酮增多組中頻率要高于其他兩組，推測(cè)這種單體型可能與原發(fā)醛固酮增多有關(guān)，但本研究的樣本量不夠大，尚需要加大樣本量研究。

中國(guó)漢族人群CYP11B2基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的分布與頻率與國(guó)外人群相比存在著種族差異。這些多態(tài)性位點(diǎn)和單體型為今后的定點(diǎn)突變研究和大樣本人群進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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