馬 靜 魏素菊 王俊艷 劉 巍 劉風(fēng)鈴 姜 達

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河北 石家莊 063000)

三陰乳腺癌(TNBC)由于對內(nèi)分泌及曲妥珠單抗治療不敏感，故其預(yù)后較其他乳腺癌差，治療較為棘手。因此，加強TNBC分子水平研究，尋找對TNBC敏感、便捷、具有預(yù)后影響意義的篩查指標(biāo)成了一個迫在眉睫的問題。本研究分別檢測了26例TNBC與非TNBC病理蠟塊中BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2的蛋白表達情況，探討它們與TNBC預(yù)后的關(guān)系,為TNBC的診治及預(yù)后判斷提供新的分子靶點。

1 材料和方法

1.1實驗材料 選取2005年及2006年于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行手術(shù)治療的乳腺癌患者的病理蠟塊，TNBC及非TNBC各26例，均為女性，術(shù)前均未接受放療、化療及其他治療，中位年齡43(23～78)歲。

1.2主要試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)、EDTA修復(fù)液、抗體稀釋液、DAB顯色劑、中性樹膠、BRCA1單克隆抗體、TopoⅡα單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體等。

1.3主要儀器 不銹鋼壓力鍋、微波爐、吹風(fēng)機、組化筆、濕盒、烤箱、振蕩器、染缸、光學(xué)顯微鏡、純木漿衛(wèi)生紙、圖像采集系統(tǒng)等。

1.4操作步驟 石蠟包埋的組織塊切片，厚度為4 μm，置烤片機上烤2 h，然后置于60℃恒溫箱過夜。石蠟切片脫蠟水化，PBS液(pH7.4)沖洗3次，每次5 min。取一定量的修復(fù)液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，繼續(xù)加熱至噴氣， 2 min后切斷電源，切片冷卻至室溫以抗原修復(fù)。PBS沖洗3次，每次5 min。3%過氧化氫室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，每次5 min。滴加4%羊血清封閉，室溫30 min，以減少非特異性染色。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2 h，采用已知陽性組織切片作陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色: 甩去PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，滿意后以自來水充分沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染:陳舊蘇木素溶液中浸泡1 min復(fù)染細胞核，0.1%鹽酸酒精分化，氨水返藍1～3 min。酒精梯度脫水干燥:75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各1次，每次5 min;二甲苯透明;中性樹膠封片。顯微鏡下觀察閱片并總結(jié)染色結(jié)果。

1.5結(jié)果判斷 BRCA1蛋白陽性染色的棕黃色顆粒主要表達在細胞核上。TopoⅡα蛋白陽性染色為棕黃色顆粒,位于胞質(zhì)和胞膜,Bcl-2蛋白陽性染色的棕黃色顆粒表達在細胞膜上,可見細胞質(zhì)同時染色。每張切片隨機選5個視野(×400)計算陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)小于20%計為0分,20%～50%計為1分,51%～75%計為2分,大于75%計為3分，0～1分計為(-)，2～3分計為(+)。見圖1，圖2，圖3。

圖1 BRCA1蛋白在乳腺癌組織中的表達(DAB,×400)

圖2 TopoⅡα蛋白在乳腺癌組織中的表達 (DAB,×400)

圖3 Bcl-2蛋白在乳腺癌組織中的表達 (DAB,×400)

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間曲線比較用Log-Rank檢驗。

2 結(jié) 果

本研究共納入52例乳腺癌患者，手術(shù)時間從2005年1月至2006年12月，均有明確的術(shù)后病理診斷及免疫組化結(jié)果。自患者術(shù)后第1天開始截止到2011年10月31日，全部病例死亡12例(23.1%)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移21例(40.4%)。BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2三個指標(biāo)陽性者較陰性者有較高的總生存率及無病生存率(見表1)。BRCA1蛋白的表達情況在TNBC與非TNBC中差異顯著，低表達與TNBC顯著相關(guān)，而TopoⅡα和Bcl-2蛋白在TNBC與非TNBC中表達無顯著差異。見表2。

表1 各蛋白陰、陽性表達組間總生存率及無病生存率比較(%)

表2 三陰及三陽組三種蛋白的陽性表達率比較〔n(%)〕

3 討 論

BRCA1基因為參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程的一種抑癌基因〔1〕。研究證實,BRCA1突變者在40歲以前發(fā)生乳腺癌的概率高達19%。BRCA1基因在不同種族和地區(qū)的突變不盡相同，BRCA1可作為輔助診斷和治療乳腺癌的生物標(biāo)記蛋白〔2，3〕。TNBC與BRCA1突變?nèi)橄侔┰诒硇吞卣骱头肿铀缴嫌性S多相似之處，如ER陰性，CK5/6、EGFR和Ki-67陽性，P53突變，核分級較高，預(yù)后較差等。Cleator等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)TNBC中大約有30%伴BRCA1基因突變，而伴BRCA1基因突變的乳腺癌中TNBC占90%。Lee等〔5〕檢測了1167例乳腺癌患者BRCA1突變情況，發(fā)現(xiàn)48%的BRCA1突變者為三陰乳腺癌，而BRCA1未突變者只有12%為TNBC。本研究提示，BRCA1突變與TNBC之間有著密切的聯(lián)系，故治療BRCA1相關(guān)腫瘤的方法也適合用于治療TNBC。體外試驗顯示BRCA1相關(guān)乳腺癌因BRCA1功能失活或缺失導(dǎo)致對能破壞DNA結(jié)構(gòu)的藥物極其敏感，如鉑類藥物。國外已進行了多項前瞻性或回顧性臨床試驗〔6～9〕均證實了鉑類藥物對TNBC有較好的療效,尤以BRCA1突變患者對順鉑更為敏感。

TopoⅡα的基因位于染色體17q21～q22位點,與HER-2基因位點相鄰,是蒽環(huán)類藥物的作用靶點,其表達缺失常引起蒽環(huán)類藥物耐藥,而過表達則對蒽環(huán)類藥物敏感。目前關(guān)于TopoⅡα的臨床研究結(jié)果并不完全一致。Nielsen等〔10〕指出TopoⅡα基因狀態(tài)可作為患者無病生存率及總生存率的預(yù)測因子，TopoⅡα基因缺失者較擴增者預(yù)后差。Chan等〔11〕研究亦闡明TopoⅡα基因擴增的患者有更長的無進展生存期。但是，Nakagawa等〔12〕卻發(fā)現(xiàn)TopoⅡα過表達與TNBC的核分級高、脈管瘤栓顯著相關(guān)。Tan等〔13〕研究表明TNBC患者很少伴有TopoⅡα基因擴增。Carey等〔14〕闡明盡管TopoⅡα基因常與Her-2基因共同擴增，但蒽環(huán)類藥物對TNBC患者卻有很好的療效。Park等〔15〕研究指出TopoⅡα基因表達才是預(yù)測蒽環(huán)類化療療效的真正標(biāo)志物,而HER-2預(yù)測蒽環(huán)類療效實際上是通過TopoⅡα表達發(fā)揮作用的。本研究中TopoⅡα陽性者較陰性者預(yù)后較好，所以對于TNBC患者檢測其TopoⅡα基因表達情況對指導(dǎo)用藥具有至關(guān)重要的作用。

Bcl-2為目前公認的一種細胞凋亡抑制基因，Bcl-2表達與腫瘤大小、細胞增殖程度、腫瘤浸潤性密切相關(guān),Poincloux等〔16〕研究顯示Bcl-2低表達與包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤預(yù)后差有關(guān)。Koronakis等〔17〕研究亦證實了TNBC與Bcl-2低表達密切相關(guān)。本研究中Bcl-2陽性者較陰性者有明顯的生存獲益，5年OS及DFS均具有顯著性差異，但TNBC與非TNBC中Bcl-2表達無明顯差異。

在2011年ASCO年會上報道了Abdel-Fatah等〔18〕的一項研究，對于接受CMF方案化療的TNBC患者，Bcl-2的表達與死亡率和復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)，具體表現(xiàn)為：Bcl-2(+)的患者為低風(fēng)險，Bcl-2(-)的患者為高風(fēng)險。以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的新輔助治療是針對Bcl-2表達水平低的TNBC患者的有效治療方法，并與較高的病理緩解率密切相關(guān)。故將Bcl-2納入到TNBC表型標(biāo)記有助于制定更好的治療方案，從而最終改善TNBC患者的預(yù)后。

4 參考文獻

1Deng CX. BRCA1: cell cycle checkpoint,genetic instability,DNA damage response and cancer evolution〔J〕. Nucleic Acids Res,2006;34(5):1416-26.

2Hall MJ,Reid JE,Burbidge LA,etal. BRCA1 and BRCA2 mutations in women of different ethnicities undergoing testing for hereditary breast-ovarian cancer〔J〕. Cancer,2009;115(10): 2222-33.

3James CR,Quinn JE,Mullan PB,etal.BRCA1,a potential predictive biomarker in the treatment of breast cancer〔J〕. Oncologist,2007;12(2):142-50.

4Cleator S,Heller W,Coombes RC,etal. Triple-negative breast cancer: the rapeutic options〔J〕. Lancet Oncol,2007;8(3):235-44.

5Lee E,McKean-Cowdin R,Ma H,etal. Characteristics of triple-negative breast cancer in patients with a BRCA1 mutation:results from a population-based study of young women〔J〕. J Clin Oncol,2011;29:4373-80.

6Staudacher L,Cottute PH,Diéras V,etal. Platinum-based chemotherapy in metastatic triple-negative breast cancer: the institut curie experience〔J〕. Ann Oncol,2011;22(4):848-56.

7Koshy N,Quispe D,Shi R,etal. Cisplatin-gemcitabine therapy in metastatic breast cancer: improved outcome in triple negative breast cancer patients compared to non-triple negative patients〔J〕. Breast,2010;19(3):246-8.

8Silver DP,Richardson AL,Eklund AC,etal. Efficacy of neoadjuvant cisplatin in triple negative breast cancer〔J〕. J Clin Oncol,2010;28(7):1145-53.

9Byrski T,Gronwald J,Huzarski T,etal. Pathologic complete response rates in young women with BRCA1-positive breast cancers after neoadjuvant chemotherapy〔J〕. J Clin Oncol,2010;28(3):375-9.

10Nielsen KV,Ejlertsen B,Moller S,etal. The value of TOP2A gene copy number variation as a biomarker in breast cancer: update of DBCG trial 89D〔J〕. Acta Oncol,2008;47(4):725-34.

11Chan S,Reis-Filho JS,Dickinson PD,etal. Use of topoisomerase Ⅱ α(TopoⅡα) protein overexpression to predict response to anthracycline-based chemotherapy〔J〕.J Clin Oncol,2011;29(15):1027.

12Nakagawa M,Bando Y,Nagao T,etal. Expression of p53,Ki-67,E-Cadherin,N-Cadherinand TOP2A in triple-negative breast cancer〔J〕. Anti Res,2011;31: 2389-94.

13Tan DS,Marchio C,Jones RL,etal. Triple-negative breast cancer: molecular profiling and prognostic impact in adjuvant anthracycline-treated patients〔J〕. Breast Cancer Res Treat,2008;111(1):27-44.

14Carey LA,Dees EC,Sawyer L,etal. The triple-negative paradox: primary tumor chemosensitivity of breast cancer subtype〔J〕. Clin Cancer Res,2007;13:2329-34.

15Park K,Kim J,Lim S,etal. Topoisomerase Ⅱα (topoⅡα) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy〔J〕. Eur J Cancer,2003;39(5): 631-4.

16Poincloux L,Durando X,Seitz JF,etal. Loss of BCL-2 expression in colon cancer: a prognostic factor for recurrence in stage Ⅱ colon cancer〔J〕. Surg Oncol,2009;18:357-65.

17Koronakis N,Karanikas G,Lagoudianakis EE,etal. Analysis of clinical and molecular associations of triple negative breast cancers in node-negative patients〔J〕. Eur J Gynaecol Oncol,2010;31(3):304-7.

18Abdel-Fatah TMA,Dickinson PD,Moseley P,etal. Bcl-2 as a surrogate prognostic and predictive marker in triple-negative breast cancer〔J〕.J Clin Oncol,2011;29:1024.