王睿君 王育民 劉雁飛 高建梅 包麗薇 戴軍有

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，起源于神經(jīng)上皮細胞，占所有原發(fā)性腦腫瘤的50%左右〔1～4〕。Neuropilins(NRPs)參與多種生理功能，包括軸突導(dǎo)向、細胞遷移、組織形成、調(diào)節(jié)血管生成、神經(jīng)創(chuàng)傷的修復(fù)〔1～3〕、信號傳導(dǎo)以及誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞的凋亡和分化〔4〕。本實驗中我們采用免疫組化方法聯(lián)合檢測Neuropilins-1(NRP-1)及Neuropilins-2(NRP-2)在腦膠質(zhì)瘤中的表達情況，分析其與膠質(zhì)瘤級別的關(guān)系及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1實驗材料 收集2008年1月至2012年1月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科就診，臨床資料保存完整的病例，行手術(shù)切除治療，術(shù)前未行放療和化療，術(shù)后病理診斷均為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，其中Ⅰ級膠質(zhì)瘤4例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤25例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤20例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤20例，其中Ⅰ+Ⅱ組為低惡性組，Ⅲ+Ⅳ組為高惡性組。另取5份正常腦組織標本作為對照，標本均為同期急性顱腦損傷患者因顱內(nèi)減壓而切除的腦組織，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2儀器與試劑 微波爐、切片機、光學顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)、微量移液器以及免疫組化所需其他材料(均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物教研室提供)。兔抗人NRP-1、NRP-2單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化染色 所有標本均用10%的甲醛固定，石蠟包埋，所有切片均有專業(yè)技術(shù)人員切成厚4 μm。應(yīng)用免疫組化檢測，簡述如下：①組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；雙蒸水洗5 min，PBS漂洗3 min×3；②熱修復(fù)抗原：微波熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)(760 W功率微波爐3檔)20 min，室溫冷卻；PBS漂洗3 min×3；③室溫下3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶20 min；PBS洗3 min×3；④20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗；⑤芯片分別置于兔抗人NRP-1、NRP-2多克隆抗體中，4℃孵育過夜；⑥即用型EnVision試劑37℃孵育30 min；PB漂洗3 min×3；⑦DAB顯色20 min，蘇木素復(fù)染2 min，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照，用隨試劑附已知陽性對照片作陽性對照。

1.4結(jié)果判斷 結(jié)果判定在盲法下進行，每張芯片由兩名病理醫(yī)師分別計數(shù)。染色強度計分：0分為無色；1分為淡棕黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細胞百分率：0分為陽性細胞百分率≤5%；1分為6%～25%；2分為26%～50%；3分為51%～75%；4分為≥75%。計算得分：0～2分為陰性；3～4分為弱陽性(+)；5～6分為陽性()；7～8分為強陽性()。

1.5統(tǒng)計學方法 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，組間比較采用秩和檢驗，各指標之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1NRP-1在各級腦膠質(zhì)瘤中的表示 腦膠質(zhì)瘤中NRP-1表達陽性率明顯高于正常腦組織(P<0.05)，且NRP-1陽性表達率隨腫瘤分級增高而增強(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 NRP-1在各級腦膠質(zhì)瘤中的表達(DAB，×200)

2.2NRP-2在各級腦膠質(zhì)瘤中的表達 腦膠質(zhì)瘤中NRP-2表達陽性率明顯高于正常腦組織組(P<0.05)，且NRP-2隨腫瘤分級增高，表達也明顯增強(P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 NRP-2在各級腦膠質(zhì)瘤中的表達(DAB，×200)

表1 NRP-1與NRP-2在各級膠質(zhì)瘤中的陽性表達〔n(%)〕

3 討 論

NRPS是一種多功能信號傳導(dǎo)蛋白，在機體的發(fā)育、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色〔5～9〕。NRP-1或它的同族NRP-2受體，能夠促進對一些生長因子或其他介導(dǎo)生理學低下和病理學條件的反應(yīng)。他們在一些內(nèi)皮細胞、幾個正常種類的細胞和惡性腫瘤細胞中表達〔9～11〕。NRP-1和NRP-2在分擔許多結(jié)構(gòu)和生物學性能上有44%的同源性〔5～9〕。研究表明〔10〕，NRP-1或NRP-2表達于多種人類腫瘤細胞系，包括前列腺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌，也表達于來自于膠質(zhì)母細胞瘤、神經(jīng)細胞瘤、骨肉瘤、白血病和黑色素瘤的細胞系，而且NRPs與惡性腫瘤的血管、淋巴管的新生和轉(zhuǎn)移都密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，隨著膠質(zhì)瘤的等級增加，NRP-1、2表達而加強。NRPS既是介導(dǎo)神經(jīng)原導(dǎo)向Semaphorins家族的受體，也是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的受體，所以NRP-1、2表達的增高，可增加腫瘤的毛細血管密度的增加，間接的為腫瘤細胞的生長和沿血管擴散提供了有利條件。Osada等〔12〕用免疫組織化學和RT- PCR 法研究發(fā)現(xiàn)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理標本中NRP-1顯著表達，并且表達強度隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度增加而增強，Adham等〔13〕揭示NRP-1的表達水平與卵巢上皮細胞癌的惡性程度有關(guān)，并且NRP-1能夠促進卵巢癌血管新生及癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。Jubb等〔10，11〕通過染色與抗體的免疫組化及原位雜交嚴格驗證分析，他們觀察到腫瘤脈管系統(tǒng)NRP-1〔10〕和NRP-2〔11〕在絕大多數(shù)情況下是陽性；NRP-2在乳腺癌和非小細胞肺癌的陽性率可以和NRP-1相提并論〔11〕；而NRP-2在黑色素瘤的陽性率為85%。NRP-2表達了更高的陽性率在乳腺癌中〔14〕。所以，NRPs不僅在腫瘤組織或穩(wěn)定的細胞株中存在高表達，而且與其發(fā)生發(fā)展、血管生成及轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。

4 參考文獻

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