段東奎 李 偉 蘇鵬飛

(南陽市中心醫(yī)院胸外科，河南 南陽 473009)

Fas相關死亡域蛋白(FADD)在許多正常和腫瘤組織中均能廣泛表達，與組織表達異?；蚬δ墚惓＜澳[瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系〔1〕。FADD主要作用通過與Fas胞漿區(qū)特異性結(jié)合中斷細胞凋亡信息的轉(zhuǎn)導過程〔2，3〕。而腫瘤抑制基因P53對腫瘤細胞的增殖分化起調(diào)控作用，P53在大多數(shù)腫瘤中均不表達，但在非小細胞肺癌(NSCLC)卻異常表達。NSCLC中FADD的表達及與細胞凋亡蛋白P53是否存在關系，尚無定論。本文擬分析FADD蛋白及P53蛋白與NSCLC臨床生物學的相關性。

1 資料與方法

1.1材料 標本取自2009年1月至2012年6月在我院住院經(jīng)手術切除的肺癌患者61例，術前均未給予放療或化療治療，男45例，女16例。年齡29～83〔平均(59.32±21.76)〕歲。經(jīng)病理確診：鱗癌37例，腺癌24例。根據(jù)TNM分期標準分為：ⅠA期0例，ⅠB期9例，ⅡA期12例，ⅡB期9例，ⅢA期12例，ⅢB期14例，Ⅳ期5例，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。距肺癌組織3 cm以上取30例癌旁正常組織作為對照組。所有標本均采用10%甲醛固定，同時用石蠟包埋。切片厚度為4 μm。

1.2主要試劑 兔抗人FADD多克隆抗體濃縮型，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。小鼠抗人P53蛋白單克隆抗體，美國SIGMA公司產(chǎn)品。免疫組化染色試劑盒，北京中杉生物技術有限公司。

1.3免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，加入0.3%H2O2甲醇，放置30 min后，采用5%山羊血清封閉背景染色。再次放置30 min后，切片加入兔抗人FADD多克隆抗體濃縮型及小鼠抗人P53蛋白單克隆抗體，比例為1∶50，同時放置于4℃的冰箱內(nèi)6～8 h。室溫37℃下，將比例為1∶100的羊抗兔和羊抗小鼠IgG加入至切片中。30 min后，切片加入比例為1∶100的鏈霉素核素-生物素復合物(SABC)。30 min后，進行DAB顯色，根據(jù)顯色程度終止反應。用自來水反復沖洗后，細胞核進行蘇木精復染。脫水、封固后在顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判斷 高倍鏡下觀察FADD及P53蛋白免疫組化染色。計算陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)(個數(shù)≥1 000)的百分比。FADD蛋白陽性反應主要為棕黃色顆粒位于細胞質(zhì)或細胞膜上，P53蛋白陽性反應主要為棕黃色顆粒位于細胞核上。以陽性細胞比例≥10%為陽性，反之為陰性。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FADD蛋白與P53蛋白測定結(jié)果 61例肺癌組織中FADD蛋白陽性率為88.52%(54/61)，30例癌旁正常組織中FADD蛋白陽性率96.67%(29/30)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。61例肺癌組織中P53蛋白陽性率為75.41%(46/61)，明顯高于30例癌旁組織(0.00%)(P<0.01)。

2.2FADD及P53蛋白表達與生物學指標的關系 見表1。FADD及P53蛋白的表達與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙史、臨床分型、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等無明顯的關系(P>0.05)，而與NSCLC的分化程度、TNM分期有關。

表1 FADD、P53蛋白表達與生物學指標之間的關系(n)

2.3FADD蛋白及P53蛋白表達的關系 61例肺癌組織中FADD蛋白及P53蛋白均表達異常僅45例，僅P53蛋白異常1例，僅FADD蛋白表達異常9例，兩種蛋白均表達正常6例，表明FADD與P53蛋白表達相關，二著具有良好的一致性(χ2=12.56，P<0.01)。

3 討 論

細胞癌變是一個復雜的生物學過程，與癌癥因子和抑癌因子的狀態(tài)密切相關〔4,5〕。大量的研究證實FADD蛋白在多種細胞受體介導的凋亡反應中起承上啟下的重要作用，是傳導過程中的重要銜接蛋白之一。但FADD蛋白在不同的癌癥中表達不同，在大部分的癌癥中FADD表達減少，而楊超等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)FADD在NSCLC中呈高表達，本實驗結(jié)果與之一致。其可能的原因：①在不同部位的細胞FADD的表達不一致。②細胞凋亡途徑半胱氨酸蛋白酶(FADD-caspase)途徑主要作用為通過傳導和放大凋亡因子發(fā)出的信號來誘導靶細胞產(chǎn)生高效、快速的凋亡反應。凋亡分子腫瘤壞死因子相關凋亡有道配體受體(TRAILR)有兩種，分別為死亡受體和誘捕受體。前一種的主要作用為直接導致細胞死亡，而后一種為抑制相關配體介導導致細胞死亡〔7〕?？紤]到細胞凋亡是機體抗腫瘤的主要機制，NSCLC中FADD高表達是否與TRAILR相關，其機制如何，則有待進一步的研究。③NSCLC中FADD基因介導的凋亡反應不依賴Fas-FasL途徑〔8〕。肺癌細胞中Fas抗體不能與FasL結(jié)合，從而導致細胞不能發(fā)生凋亡反應，造成Fas功能喪失。因此，即使肺癌細胞中Fas呈高表達狀態(tài)，但FasL不能啟動細胞的凋亡反應來殺滅肺癌細胞。本研究提示NSCLC惡性程度越高，F(xiàn)ADD的表達水平越低〔9〕。而NSCLC的預后程度與臨床分期的關系最為密切，因此，檢測手術后肺癌組織的FADD表達水平，再結(jié)合臨床分期和組織分化程度，可作為評估NSCLC預后情況的手段之一。

P53作為一種腫瘤抑制基因，其主要功能負責控制整個細胞周期的啟動〔10，11〕。細胞是否進行分裂也由P53蛋白決定，P53基因在正常情況下主要負責監(jiān)視和減慢細胞分裂過程。若細胞出現(xiàn)受損，又不能得到正常的修復，則P53蛋白將啟動細胞凋亡反應，使這個細胞死亡〔12〕。故在正常的人體細胞中，P53蛋白含量低，免疫組化無法檢測其含量。當正常細胞發(fā)生癌變時，P53基因失活，P53蛋白結(jié)構和功能發(fā)生改變，監(jiān)視和減慢細胞分裂的能力逐漸被削弱，半衰期延長，在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性增加，從而導致在細胞內(nèi)的含量增加，故能被免疫組化法檢測到〔13〕。所以，在免疫組化法檢測受檢細胞的P53蛋白表達陽性即表示細胞內(nèi)的P53蛋白已經(jīng)喪失抑癌作用。本研究結(jié)果提示了檢測P53蛋白表達水平對肺癌確診具有參考價值，但本研究陽性率未達到100%，提示在細胞癌變過程中，單一的癌基因激活并不是導致惡變的獨立危險因素，而是多種基因突變共同造成的結(jié)果〔14〕。只是在不同時期的腫瘤中，往往由一種癌基因主導腫瘤的發(fā)展過程。本研究還表明NSCLC惡性程度越高，P53的表達水平越低。P53也能作為評估NSCLC預后情況的指標之一，F(xiàn)ADD與P53表達具有良好的一致性。可作為評估NSCLC預后的手段之一。

4 參考文獻

1劉俊寶,冷維春,張愛臣,等.FADD在卵巢癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中國婦幼保健,2009；24(14):1911-3.

2郭寶文,李琪佳,楊 琳,等.凋亡相關蛋白FLIP、FADD在結(jié)直腸癌中的表達及其與細胞凋亡、增殖的關系〔J〕.第二軍醫(yī)大學學報,2010；31(8):912-3.

3余志華,馬靜方,楊春雨,等.卵巢癌組織中CREB結(jié)合蛋白和P53蛋白的表達及其臨床意義〔J〕.重慶醫(yī)學,2013；42(11):1207-9.

4閆繼東,張志勇,任淑華,等.非小細胞肺癌中Smad4與p53的表達及其意義〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2012；28(3):244-7.

5潘 琦,陳福春,武百強,等.量子點免疫熒光技術檢測EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在人肺癌組織中的表達意義〔J〕.中國病理生理雜志,2011；27(3):488-93.

6楊 超,蔣軍廣,翟建霞,等.FADD在非小細胞肺癌組織中的表達及與癌細胞凋亡的關系〔J〕.中國老年學雜志,2013；33(8):1772-3.

7Zhuang H,Gan Z,Jiang W.Functional specific roles of FADD: comparative proteomic analyses from knockout cell lines〔J〕.Mol Biosyst，2013；9(8):2063-78.

8De Poot SA,Lai KW,Hovingh ES,etal.Granzyme M cannot induce cell death via cleavage of mouse FADD〔J〕. Apoptosis,2013；18(4):533-4.

9Maki K,Sugita F,Nakamura Y,etal. Fadd and Skp2 are possible downstream targets of RUNX1-EVI1〔J〕.Int J Hematol,2013；97(1):83-91.

10Bartlett JD,Morton JP. p53: the tumour suppressor turns mitochondrial regulator〔J〕.J Physiol,2013；591(Pt 14):3455-6.

11Nubile M,Curcio C,Lanzini M,etal. Expression of CREB in primary pterygium and correlation with cyclin D1,ki-67,MMP7,p53,p63,survivin and vimentin〔J〕.Ophthalmic Res,2013；50(2):99-107.

12Farhat FS,Houhou W.Targeted therapies in non-small cell lung carcinoma: what have we achieved so far〔J〕.Ther Adv Med Oncol,2013；5(4):249-70.

13Chaft JE,Rusch V,Ginsberg MS,etal. Phase Ⅱ trial of neoadjuvant bevacizumab plus chemotherapy and adjuvant bevacizumab in patients with resectable nonsquamous non-small-cell lung cancers〔J〕.J Thorac Oncol,2013；8(8):1084-90.

14蒙健軍,藍 東,韋敏怡. P73、P53蛋白在胃癌中的表達及意義〔J〕. 廣西醫(yī)學,2010；32(5):510-2.