黃志軍

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建 福州 362000)

食管癌影響連接咽喉和胃部的食管，是食管鱗狀上皮惡性腫瘤，進(jìn)行性咽下困難為最典型的臨床癥狀〔1〕。食管癌與其他惡性腫瘤一樣雖然有基因的變化背景，涉及多因素、多階段、多基因變異積累及相互作用的復(fù)雜過(guò)程，在分子水平上涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質(zhì)的改變〔2〕。P53基因是一種與癌癥相關(guān)的基因。該基因能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)某些其他基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而起到抑制細(xì)胞增殖，修復(fù)損傷的細(xì)胞作用。P53基因的功能發(fā)生缺陷則可導(dǎo)致人體細(xì)胞異常增殖的發(fā)生〔3〕。P53基因的無(wú)效突變可導(dǎo)致其產(chǎn)生一種頂端截短的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)不能與DNA結(jié)合，無(wú)修復(fù)損傷細(xì)胞的活性。此外，這種突變還能夠直接降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性〔4〕。本研究探討食道癌和癌旁組織中P53、MDR基因的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究中資料來(lái)自于我院2011年6月至2012年6月間接受手術(shù)治療的50例食管癌患者，所有患者均為食管鱗癌，符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)確診。其中男37例，女13例，年齡60～73歲，平均年齡(67.6±2.4)歲。病變部位：胸上段11例，胸中段34例，胸下段5例。分化程度：高度分化17例，中度分化19例，低度分化14例。病理類型：潰瘍型9例，縮窄型3例，蕈傘型15例，髓質(zhì)型23例。另取食管正常黏膜標(biāo)本50份、非典型增生標(biāo)本50份，均取自癌旁組織，均經(jīng)病理學(xué)確診。

1.2方法

1.2.1P53檢測(cè)方法 采用免疫組化ABC法，試劑采用美國(guó)Maxim Biotech In產(chǎn)品，即用型單克隆抗體、免疫組化SP試劑盒均由Neo Markers公司提供，鼠抗P53單克隆抗體由上海華美公司提供。并以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。根據(jù)P53著色強(qiáng)度評(píng)價(jià)如下：陰性(-)：未見(jiàn)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；弱陽(yáng)性(+)：組織細(xì)胞染色淡或陽(yáng)性細(xì)胞<20%；中度陽(yáng)性()：染色適中或陽(yáng)性細(xì)胞20%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性()：染色深或陽(yáng)性細(xì)胞>50%。

1.2.2MDR基因檢測(cè)方法 RNA 提取采用異硫氰酸胍一步法〔5〕。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCGG-3'；下游引物5'-GTTCAACTTCTGCTCCTGA-3'；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為167 bp，反應(yīng)體系50 μl,總體積包含有0.2 mmol/L dNTP,1 μmol/L上、下游引物,3 U TaqDNA多聚酶,1×PCR緩沖液。酶切后DNA 1 μg充分混勻后，覆蓋石蠟,進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃30 min。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 1 min；50℃ 1 min；72℃ 1 min。35 個(gè)循環(huán)后延伸5 min。取10 μg擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳,電壓100 V，電泳120 min后,紫外透射檢測(cè)電泳帶并照相。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，用二項(xiàng)Logistic回歸模型對(duì)手術(shù)比例進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1不同食管癌組織中P53的表達(dá) 本研究3組標(biāo)本中食管鱗癌患者P53陽(yáng)性為68%(34/50)，癌旁正常黏膜P53陽(yáng)性為54%(27/50)，癌旁非典型增生P53陽(yáng)性為70%(35/50)。

2.2P53與MDR-1的關(guān)系 食管癌組織中P53陽(yáng)性表達(dá)34例中MDR-1陽(yáng)性表達(dá)13例，16例P53陰性表達(dá)中9例MDR-1陰性表達(dá)；二者表達(dá)有高度相關(guān)性。

2.3不同食管癌組織MDR-1的表達(dá) 高度分化組織中MDR-1的表達(dá)(n=17，0.38±0.061)與中度分化(n=19，0.325±0.042)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中度分化組織中MDR-1的表達(dá)與低度分化(n=14，0.217±0.087)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；低度分化組織中MDR-1的表達(dá)與正常組織(n=50，0.076±0.030)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4P53在不同食管癌臨床特征中的表達(dá) 在不同年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)上P53基因的表達(dá)無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 P53在不同食管癌臨床特征中的表達(dá)〔n(%)〕

3 討 論

P53基因與人類腫瘤相關(guān)性高，是一種重要的抑癌基因。P53基因編碼的53 kD的蛋白在細(xì)胞周期中起重要的調(diào)節(jié)作用，正常情況下具有生長(zhǎng)抑制作用，在細(xì)胞周期中對(duì)DNA損害的反應(yīng)、細(xì)胞死亡和分化等方面有重要作用〔6〕。正常的P53基因編碼53 kD的蛋白，在細(xì)胞周期中起重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)細(xì)胞癌變有抑制作用，并由此而得名。當(dāng)該基因發(fā)生點(diǎn)突變、缺失和滅活時(shí)，即由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃停炊龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔7〕。P53基因(抑癌基因)的缺失，引起家族性各種不同癌癥的發(fā)生，這些不同的癌癥包括乳癌、腦瘤、惡性肉瘤、骨癌等，很多都是在年輕時(shí)發(fā)生的，是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳疾病〔8〕。主要的特征有早發(fā)性的癌癥(小于45歲)、同時(shí)發(fā)生多種部位癌癥或肉瘤。確定的診治需要經(jīng)基因檢測(cè)確定。

P53抑癌基因是生物體內(nèi)一種抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)變癌細(xì)胞的基因〔9〕。細(xì)胞中本來(lái)就有致癌基因(oncogene)及抑癌基因的存在，只要一方產(chǎn)生病變而失去平衡，癌癥就可能會(huì)發(fā)生。當(dāng)P53基因發(fā)生突變后，由于空間構(gòu)象影響到轉(zhuǎn)錄活化功能及P53蛋白的磷酸化過(guò)程，這不僅失去抑制腫瘤增殖的作用，而且突變本身又使該基因具備癌基因的功能〔10〕。突變的P53形成的寡居蛋白不能結(jié)合DNA，使得一些癌變基因轉(zhuǎn)錄失控導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔11〕。值得提出的是，所謂“抑癌基因”也是在腫瘤研究過(guò)程中命名的。事實(shí)上，細(xì)胞抑癌基因也是細(xì)胞染色DNA的正常組成成分，具有重要的生理功能。除了腫瘤之外，它們?cè)诙喾N疾病中發(fā)揮重要作用〔12〕。本研究提示MDR 基因及突變型P53在食管癌、癌旁組織中均呈高水平表達(dá)，癌旁組織中MDR有表達(dá)，P53基因突變?cè)缬诮M織形態(tài)學(xué)改變。目前研究均表明P53基因突變及缺失均預(yù)示著腫瘤預(yù)后差，對(duì)常規(guī)化療不敏感，腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，正確評(píng)價(jià)P53基因狀態(tài)至關(guān)重要。

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