潘力健 龔 輝 劉 磊 王 昕

(復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 201508)

冠心病是我國老年人群中常見的疾病，嚴重影響患者生存質(zhì)量，是導(dǎo)致老年人群死亡的重要疾病之一，近年呈上升趨勢〔1〕。研究表明〔2～4〕，血栓的形成是引起冠心病患者死亡的危險因素，而由組織因子(TF)啟動的凝血系統(tǒng)在血栓形成過程中起到重要的作用，而一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮功能中最重要的介質(zhì)。近年相關(guān)研究指出〔5〕，內(nèi)源性NO抑制物水解酶-二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)、內(nèi)源性NO合酶抑制物-非對稱性二甲基精氨酸(ADMA) 屬于內(nèi)源性NO生成系統(tǒng)，對維持及穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞功能具有重要的作用。本文將對DDAH-ADMA系統(tǒng)對老年冠心病患者TF表達影響進行研究，并從血栓形成的角度分析ADMA在冠心病發(fā)病機制中的作用，為冠心病臨床診治提供新的研究思路。

1 資料及方法

1.1臨床資料 選取本院2011年12月至2013年2月收治的45例老年冠心病患者為冠心病組，納入標準：(1)患者均經(jīng)冠狀動脈造影術(shù)確診；(2)年齡≥60歲；(3)在知情同意下參與研究；(4)入選病例獲得本院倫理醫(yī)學委員會審批。排除標準：全身性疾病感染、心源性休克、心腦血管、血液疾病、惡性腫瘤、肝腎功能異常等患者。男28例，女17例，年齡61～82〔平均(70.3±5.4)〕歲。根據(jù)Gensini積分對患者進行分級，其中1分：6例，2分：10例，4分： 8例，8分：11例，16分：10例。另選取40例老年健康體檢者為對照組，男22例，女18例，年齡45～80〔平均(68.5±4.8)〕歲。

1.2方法

1.2.1DDAH mRNA測定 靜脈抽取兩組靜脈血10 ml，采用RT-PCR(購于日本TAKAPA公司)測定兩組外周血內(nèi)皮祖細胞中DDAH mRNA含量，設(shè)計針對人DDAH PCR的探針序列以及熒光檢測引物，選擇人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，(由美國西格瑪公司提供)作為測試的內(nèi)參物，并采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取RNA，熒光定量PCR實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行。DDAH mRNA相對表達量=目的基因/內(nèi)參基因。

1.2.2免疫組化法測定ADMA 靜脈抽取兩組靜脈血10 ml，經(jīng)離心處理后棄去下層混濁液，留取上清液，置于-20℃冰箱中保存待測，并采用ADMA酶聯(lián)免疫試劑盒(由上海生物儀器設(shè)備公司提供)測定兩組ADMA含量，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.3NOS、TF、磷脂酰膽堿(LPC)的水平測定 采用胰蛋白酶對血漿細胞進行消化，并調(diào)整細胞濃度至2×103/ml，并按照1/1 000將無血清培養(yǎng)液稀釋至10 μmol/L，并將樣品置于37℃培養(yǎng)箱中孵化20 min，采用無血清細胞培養(yǎng)液對樣本洗滌3次后，采用美國貝克曼庫爾特有限公司提供型號EPICS流式細胞儀測定細胞中NO合酶(NOS)、TF、LPC平均熒光強度(單位為mfi)，檢測細胞數(shù)目不應(yīng)少于10 000個。

2 結(jié) 果

2.1兩組 DDAH mRNA水平分析 冠心病組DDAH mRNA相對表達量為(0.78±0.21)，對照組相對表達量為(1.28±0.51)，隨著患者Gensini積分升高，DDAH mRNA相對表達量顯著下降，與對照組相比，冠心病組ADMA含量顯著上升，且患者Gensini積分升高ADMA含量顯著升高，兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組NOS、TF、LPC含量分析 冠心病組NOS、TF、LPC水平顯著高于對照組，且隨著Gensini積分升高，NOS、TF、LPC水平顯著增加(P<0.05)，見表2。

2.3DDAH、ADMA與NOS、TF、LPC相關(guān)性分析 經(jīng)相關(guān)性分析可知，DDAH與NOS、TF、LPC呈負相關(guān)(r分別為-0.362、-0.376、-0.039，均P<0.05)，而ADMA與NOS、TF、LPC呈正相關(guān)(r分別為0.402、0.396、0.358，均P<0.05)。

表1 各組 DDAH mRNA、ADMA水平分析

表2 各組NOS、TF、LPC含量分析

3 討 論

目前普遍認為冠心病的發(fā)病機制是血栓的形成及動脈粥樣斑塊破裂引起的，而TF血栓及斑塊的形成過程中起到重要的促進作用〔6〕。血管內(nèi)皮是血管間質(zhì)細胞與血液之間的半透性膜，其對維持及穩(wěn)定血流動力學具有重要的意義〔7〕。在正常狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞幾乎不產(chǎn)生TF，但當血管內(nèi)皮出現(xiàn)病理性改變或血管功能形態(tài)受損時可誘導(dǎo)血管產(chǎn)生大量的TF，并激活纖維蛋白原及凝血酶原，進而促進血栓形成〔8〕。在NOS催化作用下，細胞中L-精氨酸可大量生成NO，NO是維持及穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能的重要物質(zhì)，可抑制血栓的形成〔9〕。

ADMA屬于內(nèi)源性NOS抑制物，可抑制NO合成，進而對血管內(nèi)皮造成損傷，破壞機體血流動力學平衡〔10〕。Davids等〔11〕長期給予小鼠ADMA物質(zhì)，結(jié)果顯示ADMA可引起小鼠微血管粥樣化，與正常小鼠相比，其體內(nèi)NO生成顯著減少。近期研究指出〔12〕，ADMA可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞老化及凋亡，并可抑制血管新生，促使血管泡沫細胞形成，增加內(nèi)皮細胞黏附，促進血栓形成。近年研究指出〔13〕，ADMA是以甲基化蛋白作為底物經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶催化生成的，是由于DDAH代謝失活引起的，因此采用DDAH抑制劑可有效抑制DDAH基因過度表達。DDAH主要分布在內(nèi)皮型NOS組織中。Ivashchenko等〔14〕研究指出在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)過程中增加NO濃度，能有效抑制DDAH活性，而降低DDAH活性則使得細胞內(nèi)ADMA水平增加，從而抑制NOS活性，使得NO生成減少，因此DDAH-ADMA系統(tǒng)屬于內(nèi)源性NO生成系統(tǒng)，DDAH-ADMA系統(tǒng)對維持及穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能起到重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果與伊桐凝等〔15〕一致，從而提示ADMA水平上升可抑制DDAH表達，且隨著患者病情的進展，DDAH的表達量顯著受到抑制。此外，本研究還提示ADMA水平上升與血管內(nèi)皮功能障礙有密切關(guān)系，ADMA可誘導(dǎo)及促進內(nèi)皮細胞老化及凋亡，介導(dǎo)機體炎癥因子生成，促進動脈粥樣硬化的形成。近年臨床實驗研究顯示，冠心病患者血漿ADMA水平顯著高于正常人群，且ADMA水平升高的患者其發(fā)生心血管事件的風險顯著上升，且預(yù)后效果較差。ADMA可介導(dǎo)DDAH表達下降，使得NOS、TF、LPC表達上調(diào)，且隨著患者病情的發(fā)展，DDAH水平顯著上升，NOS、TF、LPC表達量顯著增加，從而加重了對血管內(nèi)皮的損傷。

綜上，冠心病病情的發(fā)生及進展與DDAH-ADMA通路參與NOS、TF、LPC表達有密切關(guān)系，通過對DDAH-ADMA系統(tǒng)對血管內(nèi)皮細胞影響機制的研究，可更好地了解冠心病發(fā)病的機制，為臨床冠心病防治提供新的治療思路。

4 參考文獻

1王錦生,趙新平,徐忠敏,等.冠心病高危人群的信息化互動管理〔J〕.中國老年學雜志,2012；32(14):3096-7.

2楊晶晶,石 柔,宋滇平.DDAH/ADMA系統(tǒng)與2型糖尿病動脈粥樣硬化風險因素的關(guān)系〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013；7(7):3090-2.

3趙 巍,李海菊.綜合護理干預(yù)對冠心病患者治療依從性及療效的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2012；12(33):6524-7.

4劉立生,王冬梅,高 巖,等.普羅布考對急性腦梗死抗氧化及改善內(nèi)皮功能的作用研究〔J〕.中國全科醫(yī)學,2013；16(18):2130-2.

5Peng ZY,Zhang SD,Liu S,etal.Protective effect of neferine on endothelial cell nitric oxide production induced by lysophosphatidylcholine:the role of the DDAH-ADMA pathway〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2011；89(4):289-94.

6徐文娟,馮 梅,劉麗華,等.卡托普利對動脈粥樣硬化家兔血管內(nèi)皮功能的保護作用及其機制〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志,2012；26(6):816-22.

7金遠志,王邦寧,胡澤平,等.冠心病患者血漿非對稱性二甲基精氨酸和同型半胱氨酸濃度變化及臨床意義〔J〕.中國臨床保健雜志,2011；14(1):31-3.

8Chobanyan-Jürgens K,Fuchs AJ,Tsikas D,etal.Increased asymmetric dimethylarginine (ADMA) dimethylaminohydrolase (DDAH) activity in childhood hypercholesterolemia type Ⅱ〔J〕.Amino Acids,2012；43(2):805-11.

9Yi TN,Zhang J,Yu SJ,etal.Alterations in reactive oxygen species and dimethylarginine dimethylaminohydrolase-asymmetric dimethyl-arginine system in the process of endothelial cell senescence induced by high glucose〔J〕.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2011；23(5):275-8.

10Ghebremariam YT,Erlanson DA,Yamada K,etal.Development of a dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH) assay for high-throughput chemical screening〔J〕.J Biomol Screen,2012；17(5):651-61.

11Davids M,Teerlink T.Plasma concentrations of arginine and asymmetric dimethylarginine do not reflect their intracellular concentrations in peripheral blood mononuclear cells〔J〕.Metabolism,2013；62(10):1455-61.

12張 威,袁偉杰,陳 博,等.ADMA-DDAH路徑在尿酸引起血管內(nèi)皮損傷中的作用〔J〕.中華腎臟病雜志,2011；27(1):17-22.

13劉秀娟,穆 恩,梁英健,等.高糖培養(yǎng)脂多糖刺激下肺臟微血管內(nèi)皮細胞通透性改變及DDAH/NOS/NO失平衡在其發(fā)生機制中的作用〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學,2013；25(3):140-4.

14Ivashchenko CY,Bradley BT,Ao Z,etal.Regulation of the ADMA-DDAH system in endothelial cells:a novel mechanism for the sterol response element binding proteins,SREBP1c and -2〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010；298(1):251-8.

15伊桐凝,張 錦,于世家,等.高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老過程中活性氧與二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非對稱性二甲基精氨酸系統(tǒng)的變化〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學,2011；23(5):275-8.