王巧云 劉 鳳 李金蓮 楊 靜

(濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 煙臺 264003)

人參皂苷Rb3是五加科植物人參、西洋參、三七等的主要藥理活性成分，主要存在于人參的根、花蕾、莖葉和西洋參的根、莖葉以及三七的莖葉中?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3可顯著保護(hù)腦缺氧缺糖導(dǎo)致的缺血損傷，機(jī)制可能保護(hù)線粒體功能、拮抗鈣離子、抑制細(xì)胞凋亡及caspase活性有關(guān)〔1，2〕。目前，mitoKATPC通道在心腦保護(hù)中的地位已引起廣泛關(guān)注，也有研究報(bào)道三七總皂苷(Rb3為主要成分之一)對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與mitoKATPC開放有關(guān)。mitoKATPC是否也參與人參皂苷Rb3抗腦缺血缺性損傷的凋亡作用，尚未見報(bào)道。本研究以O(shè)GD/R皮層神經(jīng)細(xì)胞為研究對象，觀察人參皂苷Rb3的抗凋亡作用及離子通道機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物 人參皂苷Rb3 (南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度為98%，批號： ZL201003)。

1.2動物 新生24 h Wistar大鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，合格證號：SCKX(京)2004-0001。

1.3試劑與儀器 MEM/F12培養(yǎng)基，購自Gibco公司；胰蛋白酶、Hochest 33342、5-HD，均購自Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)、馬血清為Hyclone產(chǎn)品；兔抗大鼠 MAP-2抗體、羅丹明標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗由北京中杉試劑公司提供；兔抗PARP 為Santa Cruz 產(chǎn)品；Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；其他為國產(chǎn)分析純。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS-IX71)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，Spectra Max M5 酶標(biāo)儀(Molecular Devices 公司)，低溫離心機(jī)(德國Beckman 公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠皮層神經(jīng)元的原代體外培養(yǎng)及鑒定〔3，4〕

1.4.1.1包被培養(yǎng)板 細(xì)胞培養(yǎng)前2 h，用0.1‰多聚賴氨酸(PLL)包被24孔培養(yǎng)板，置5% CO2培養(yǎng)箱中，使用前用D-Hank′s液沖洗干凈。

1.4.1.2皮層的分離 取新生1 d的Wistar乳鼠，75%乙醇皮膚消毒后，剝離皮膚及顱骨，暴露并取出完整的腦組織，解剖顯微鏡下去除血管、腦膜及海馬，分離出皮層組織。

1.4.1.3消化 用眼科剪將皮層組織剪成直徑為1 3 mm3的小塊，剪碎后移入無菌離心管中。加入0.125%的胰蛋白酶4 ml， 37℃消化約20 min。然后以完全培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 r/min)10 min。

1.4.1.4細(xì)胞收集 棄去上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液3～5 ml，以吸管輕輕吹打細(xì)胞至細(xì)胞分散，然后經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞。

1.4.1.5細(xì)胞計(jì)數(shù) 取樣，用計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/L。接種1.0 ml/孔 于24孔培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。24 h后換液，以除去懸浮死亡的細(xì)胞。于接種的第3天，吸去培養(yǎng)基，加入終濃度為3 μmol/L的阿糖胞苷24 h(每孔1 ml)，以抑制非神經(jīng)元生長。以后每周換液2次，每次換半液，定時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，并進(jìn)行顯微攝影。培養(yǎng)置10～12 d開始試驗(yàn)。

1.4.1.6大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的鑒定-微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)熒光染色檢測 細(xì)胞培養(yǎng)第 10 天進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測，以證實(shí)其性質(zhì)及純度。過程如下：將培養(yǎng)液棄去，以 0.01 mol/L的PBS (pH 7.4，37℃)洗滌三次，4% 多聚甲醛室溫固定 20 min，0.3% Triton X-100 作用 15 min 將細(xì)胞穿孔，再由 PBS 孵育 3×3 min，吸棄 PBS，滴加一滴 10% 羊血清，孵育10 min后棄去，各孔加入兔抗大鼠 MAP-2抗體(1∶400)，4℃過夜，次日 PBS 沖洗后(3×10 min)，滴加第二抗體-羅丹明標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶800)，常溫孵育2 h，孵育結(jié)束前 20 min 加入2 μg/ml的Hoechest 33342。由 PBS 沖洗 4×10 min，吹干后立即由緩沖甘油封固，置熒光顯微鏡下觀察表達(dá)陽性的細(xì)胞，每孔隨機(jī)取6個(gè)視野，記錄3孔，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4.2原代神經(jīng)元低糖低氧/復(fù)氧模型建立〔5〕制備模型前以無糖Earle′s平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次為原完全培養(yǎng)基體積的2/3，使葡萄糖終濃度小于1 mmol/L。每孔加入100 μl 終濃度為10 mmol/L Na2S2O4無糖Earle液，于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養(yǎng)基，再置入CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將以上培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組：正常對照組：正常換液培養(yǎng)；在制備OGD模型時(shí)同步換以含糖Earle液。低糖低氧再灌注損傷組(OGD/R)：終濃度為10 mmol/L Na2S2O4無糖Earle液，于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養(yǎng)基，再置入CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，模擬體內(nèi)缺血再灌注的過程。人參皂苷Rb3組、5-HD組：換以完全培養(yǎng)基后，分別加60 mol/L人參皂苷Rb3、5-HD，作用30 min后行OGD/R損傷。60 mol/LRb3+5-HD組：人參皂苷Rb3作用15 min后，加入5-HD，15 min后行OGD/R。

1.4.4熒光素染料Hoechst33342測定皮層神經(jīng)元凋亡 模型制備結(jié)束，吸除培養(yǎng)液， PBS 清洗三次，加入染色液(Hoechst 33342/DMEM，5 μmol/L)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光染色10 min，無血清無酚紅培養(yǎng)劑清洗三次，于倒置熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右)細(xì)胞核染色情況。并于20×10高倍鏡下每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)取5個(gè)不同視野，計(jì)算凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，以反應(yīng)皮層神經(jīng)元凋亡程度。

1.4.5Western 印跡檢測PARP的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)處理后收集，細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，13 000 r/min離心20 min 后提取上清液即為細(xì)胞總蛋白質(zhì)。每泳道取50 mg 蛋白質(zhì)在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳， 將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液(TBS+5%脫脂奶+5% tween 20)室溫封閉1 h，加入一抗(1∶5 000兔抗PARP)封閉后，作用3 h，取出膜，用TBS-T漂洗膜10 min×3 次，洗滌后加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶2 000)室溫封閉30 min。室溫?fù)u床上持續(xù)平緩搖動1 h，TBS-T 漂洗膜10 min×3 次?；瘜W(xué)發(fā)光法(ECL) 曝光膠片，顯色檢測相應(yīng)蛋白條帶。

1.4.6caspase-3 活性測定 活化的caspase-3 可催化底物Ac-DEVD-pNA，產(chǎn)生黃色的pNA，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase-3 的活性。同上收集細(xì)胞總蛋白。caspase-3 活性檢測于96 孔板中進(jìn)行，每孔加入待測樣品40 μl，caspase-3 底物20 μmol/L，終體積為100 μl，并設(shè)置空白對照?；靹蚝?7℃孵育2 h，于405 nm 處測定OD值。實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)制備pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終caspase-3的活性以正常對照組為標(biāo)準(zhǔn)，其余各組與之相比表示。

2 結(jié) 果

2.1大鼠原代皮層神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第10天胞體飽滿，背景清晰，折光性強(qiáng)，突起分支較多且形成網(wǎng)絡(luò)(圖1)。MAP-2在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和突起中呈陽性表達(dá)，其免疫熒光染色能夠反映出細(xì)胞性質(zhì)及純度。對培養(yǎng)至10 d的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞胞體飽滿，突起粗大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒明顯，與形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果相吻合，提示神經(jīng)細(xì)胞生長良好。經(jīng)鑒定，神經(jīng)細(xì)胞的純度為 81.34%(圖1)。

圖1 原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元(×400)

2.2熒光素染料Hoechst33342測定人參皂苷Rb3對OGD/R誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst 33342是一種親嗜DNA 的熒光染料，與DNA 發(fā)生特異性結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可檢測到藍(lán)色熒光，清楚地顯示核的形態(tài)、大小及核質(zhì)的密度。正常細(xì)胞呈均勻的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核膜光滑無皺縮、無濃縮及碎裂征，可見圓形細(xì)胞核；OGD/R損傷后，細(xì)胞核皺縮變小，密度增加，并發(fā)生濃縮，碎裂呈三角形、圓形或多邊形的團(tuán)塊；正常對照組皮層神經(jīng)元的凋亡率為(2.67±0.42)%，OGD/R組表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡，凋亡率為(47.12±1.23)%；與OGD/R組比較，人參皂苷Rb3組(60 mol/L)可以降低OGD/R后皮層神經(jīng)元的凋亡率(26.641±1.35)(P<0.01)。但5-HD則削弱了人參皂苷抗OGD/R損傷的細(xì)胞凋亡作用，使5-HD組及人參皂苷Rb3+5-HD組細(xì)胞凋亡率分別為(44.32±2.44)%及(37.12±1.23)%。見圖2。

2.3人參皂苷Rb3對OGD/R損傷后細(xì)胞中PARP的影響 如圖3所示，在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，PARP表達(dá)較高(1.00±0.03)；而OGD/R損傷后，PARP的表達(dá)明顯減低(0.58±0.13)，提示表明其完整性被破壞；人參皂苷Rb3作用后明顯提高了PARP的表達(dá)水平(0.88±0.07)，與OGD/R損傷組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，提示人參皂苷Rb3能夠通過維持PARP的完整性而對皮層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。5-HD亦使PARP的完整性受到破壞，與OGD/R組無顯著性差異(0.64±0.07,P>0.05)。但5-HD減弱了人參皂苷Rb3引起的PARP完整性作用(0.76±0.04,P<0.01)。

圖2 Hoechst 33342染色示OGD/R誘導(dǎo)致皮層神經(jīng)元細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變(×400)

A：正常對照組；B：OGD/R組；C：人參皂苷Rb3組；D：5-HD組;E：人參皂苷Rb3+5-HD組

2.4人參皂苷Rb3 對OGD/R損傷后細(xì)胞中caspase-3活性的影響 在正常情況下，caspase-3 活性較低(1.00±0.04)；OGD/R后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)caspase-3 的活性明顯升高(3.53±0.19)，約為損傷組的3.14 倍；人參皂苷Rb3明顯降低了caspase-3 的活性(1.71±0.13,P<0.01)。而應(yīng)用5-HD后，caspase-3 的活性增高，與OGD/R損傷組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(3.08±0.12,P>0.05)。但5-HD削弱了人參皂苷Rb3對caspase-3活性的抑制作用，使caspase-3活性約增加1.43倍(2.45±0.16)。

3 討 論

mitoKATP是一種存在于心肌細(xì)胞線粒體膜上的主要鉀通道，近年來，mitoKATP的激活在腦缺血缺氧保護(hù)中的作用越來越引人注目，大量研究顯示在腦缺血缺氧過程中，mitoKATP開放，K+內(nèi)流，膜去極化，減輕線粒體內(nèi)Ca2+超載；減少自由基損傷，維持線粒體膜穩(wěn)定性，延緩和減輕細(xì)胞凋亡〔6，7〕。

本研究通過缺氧復(fù)氧成功誘導(dǎo)了乳鼠神經(jīng)元凋亡，通過DNA熒光染色Hoechst染色觀察到人參皂苷Rb3干預(yù)后對體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3可以明顯降低缺氧/復(fù)氧后神經(jīng)元的凋亡率，改善細(xì)胞形態(tài)。在應(yīng)用人參皂苷Rb3預(yù)處理的同時(shí)應(yīng)用mitoKATPC特異阻斷劑5-HD則消弱了其抑制神經(jīng)元凋亡作用。

PARP是定位在細(xì)胞核內(nèi)，在應(yīng)激條件下與DNA修復(fù)密切相關(guān)的一種酶，它的存在對于細(xì)胞的穩(wěn)定和存活非常重要。PARP在體外可以被多種caspases剪切，在體內(nèi)則是caspase-3的主要剪切對象，因此，PARP的剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，也通常被認(rèn)為是caspase-3激活的指標(biāo)。在正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，PARP表達(dá)較高，caspase-3活性也較低；而OGD/R損傷后，PARP的表達(dá)明顯減低，提示其完整性受到破壞，同時(shí)凋亡蛋白caspase-3活性增強(qiáng)，神經(jīng)元凋亡率增高；人參皂苷Rb3明顯提高了PARP的表達(dá)水平，降低了caspase-3活性，與OGD/R損傷組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而5-HD則削弱了人參皂苷Rb3對PARP完整性的維持，增強(qiáng)了caspase-3的活性，促使神經(jīng)元凋亡，即5-HD抑制了人參皂苷Rb3的抗凋亡作用。由此推測，人參皂苷Rb3可能通過開放mitoKATPC，抑制激活的caspase-3對其特異性底物進(jìn)行裂解而緩解細(xì)胞凋亡，起到腦缺血保護(hù)。

4 參考文獻(xiàn)

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