孫 健 李 昱 賈 舒 宋貴軍

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

認(rèn)知功能障礙是多種神經(jīng)疾病的常見(jiàn)表現(xiàn)，影響了患者生活質(zhì)量、增加家庭負(fù)擔(dān)，甚至可發(fā)展為阿爾茨海默病〔1〕。除神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病外，外傷及腦出血也可導(dǎo)致認(rèn)知障礙，其中病變神經(jīng)元未能完成被新生神經(jīng)元替代是影響認(rèn)知功能恢復(fù)的關(guān)鍵〔2〕。海馬在調(diào)控認(rèn)知的關(guān)鍵部位，該部位的神經(jīng)元再生情況是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)〔3〕。氧化應(yīng)激在認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用，研究指出給予外源性自由基可促進(jìn)神經(jīng)元再生，而在阿爾茨海默病模型中給予自由基清除劑可減弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，提示抗氧化是改善認(rèn)知障礙的可行措施〔4〕。依達(dá)拉奉(ED)是一種自由基清除劑，具有神經(jīng)保護(hù)作用，并推測(cè)其可能對(duì)認(rèn)知功能障礙的學(xué)習(xí)記憶功能損傷及神經(jīng)元再生有改善作用。本研究擬觀察ED對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元再生的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康雄性ICR小鼠30只(購(gòu)于北京維通利華公司)，體重25～30 g，采用側(cè)腦室注射Aβ25～35制備認(rèn)知障礙模型，隨機(jī)分為：模型組、ED低劑量(ED-L)組和高劑量(ED-H)組。其中ED-L組和ED-H組均在側(cè)腦室注射1 w后腹腔注射5 mg/kg和10 mg/kg ED(1次/d，連續(xù)4 w)，模型組僅給予等體積生理鹽水。同時(shí)選取10只同周齡ICR小鼠作對(duì)照(對(duì)照組)。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均飼養(yǎng)穩(wěn)定1 w，各組大鼠均可自由獲取食物和水，且飼養(yǎng)條件相同。

1.2試劑 Aβ25～35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司，依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自江蘇先聲藥業(yè)生產(chǎn)公司，其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1認(rèn)知障礙小鼠模型制備 將預(yù)先溶解于雙蒸水中的Aβ25～35肽段(3 mmol/L)在37℃水浴中孵育，96 h后用于側(cè)腦室注射。待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，給予2%水合氯醛腹腔麻醉(10～20 ml/kg)，待角膜反射消失后，置于立體定位儀，顱頂正中切開(kāi)長(zhǎng)約2 cm切口，暴露顱底頂，以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)，根據(jù)小鼠側(cè)腦室坐標(biāo)(前囟點(diǎn)后0.3 mm，右側(cè)1 mm，深2.5 mm)微量注射Aβ25～35(總量約為5 nmol，體積控制在3 μl內(nèi))，留針不少于3 min，保證Aβ25～35進(jìn)入側(cè)腦室。對(duì)照組的手術(shù)操作步驟相同，僅注射等體積的生理鹽水。術(shù)后縫合皮膚及常規(guī)消毒。

1.3.2學(xué)習(xí)和記憶功能檢測(cè) 采用Y型迷宮檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。預(yù)先將小鼠置于迷宮內(nèi)以適應(yīng)環(huán)境，3～5 min后給予適當(dāng)電壓電擊足部(約70 mV)，導(dǎo)致其向迷宮的3等分輻射式反射箱逃避，反射箱的3個(gè)輻射臂中僅有1個(gè)為安全，內(nèi)置于輻射臂中的信號(hào)燈亮提示安全。小鼠由電擊區(qū)域逃至無(wú)電輻射臂定義為正確反應(yīng)，其中連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)所需電擊次數(shù)為學(xué)習(xí)成績(jī)，而連續(xù)10次測(cè)試中的正確反應(yīng)次數(shù)為記憶成績(jī)，分別用于評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)能力和記憶能力。

1.3.3ELISA法檢測(cè)海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 將完成Y型迷宮的小鼠過(guò)量麻醉處死，迅速取出腦，用預(yù)冷PBS溶液沖洗血漬，放入液氮達(dá)到適當(dāng)硬度，取出海馬部位，冰上研磨并充分裂解，高速離心(12 000 r/min×20 min)，小心吸出上清液并等分為3份，分別用于檢測(cè)MDA、BDNF水平及SOD活性，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.4神經(jīng)元再生及活性氧檢測(cè) 用冰凍切片機(jī)對(duì)海馬進(jìn)行冠狀連續(xù)切片(40 μm)，每5張保留1張，每個(gè)海馬取8張片，分別行特異性熒光探針DHE染色和DCX染色，置于高倍顯微鏡下，觀察各組的熒光強(qiáng)度、神經(jīng)元前體細(xì)胞的長(zhǎng)度和密度。

2 結(jié) 果

2.1各組的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī) 模型組的學(xué)習(xí)次數(shù)多于對(duì)照組，而記憶次數(shù)小于對(duì)照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的學(xué)習(xí)次數(shù)增多和記憶次數(shù)減少，ED-L組和ED-H組的學(xué)習(xí)次數(shù)少于模型組，記憶次數(shù)多于模型組(P<0.05)，但仍與對(duì)照組有差異；ED-H組對(duì)學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善效果強(qiáng)于ED-L組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 四組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)±s,n=10)

2.2各組海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 模型組的海馬MDA水平高于對(duì)對(duì)照組，BDNF水平和SOD活性均低于對(duì)照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的MDA水平升高及BDNF水平和SOD活性降低， ED-L組和ED-H組的MDA水平低于模型組，BDNF水平和SOD活性均高于模型組(P<0.05)，但仍與對(duì)照組有差異；ED-H組對(duì)MDA、BDNF水平及SOD活性的改善效果強(qiáng)于ED-L組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 四組小鼠海馬的GAP-43、MDA水平及SOD活性±s,n=10)

2.3各組海馬的活性氧自由基水平比較 模型組的海馬熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ED-L組和ED-H組的熒光強(qiáng)度均低于模型組(P<0.05)，但仍與對(duì)照組有差異；ED-H組對(duì)海馬增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的減弱效果強(qiáng)于ED-L組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 四組小鼠海馬的DHE和DCX染色情況±s,n=10)

2.4各組海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度 模型組海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度均低于對(duì)照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度降低，ED-L組和ED-H組的神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度均高于模型組(P<0.05)，但仍與對(duì)照組有差異；ED-H組對(duì)神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度的改善作用均強(qiáng)于ED-L組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

3 討 論

ED是一種自由基清除劑，在臨床上用作腦保護(hù)劑，可保護(hù)神經(jīng)免受缺血缺氧導(dǎo)致的損傷。此外，其在臨床和動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)急性缺血性腦血管病有非常好的療效，并在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥也有滿意的治療作用〔6，7〕。除可減弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性外，ED還可降低NMDA誘導(dǎo)的cyt c釋放和細(xì)胞凋亡〔8〕。以上均提示ED在改善認(rèn)知障礙上有一定的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)：Aβ25～35處理可誘導(dǎo)認(rèn)知障礙，主要原因?yàn)锳β25～35是淀粉樣蛋白的一種片段，可引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變，如神經(jīng)元胞體死亡、突觸丟失及繼發(fā)的學(xué)習(xí)記憶功能受損〔9〕。而給予ED處理后，Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙成功后出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶功能獲改善，提示ED對(duì)認(rèn)知障礙有改善作用，與之前的推測(cè)一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Aβ25～35處理后海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度均降低，而神經(jīng)元前體細(xì)胞是神經(jīng)元再生的基礎(chǔ)，表明認(rèn)知障礙小鼠的神經(jīng)元再生受抑制，是導(dǎo)致Aβ25～35處理小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降的根本原因，而給予ED處理后，可發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的突起長(zhǎng)度和密度增加，同時(shí)BDNF水平升高，表明ED可促進(jìn)海馬部位神經(jīng)元再生。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的自由基損傷在多種疾病的認(rèn)知障礙中有重要作用，而MDA水平和SOD活性是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的經(jīng)典指標(biāo)〔10，11〕。本研究中Aβ25～35處理小鼠的MDA水平升高，SOD活性下降，提示Aβ25～35處理引起氧化應(yīng)激，ED處理后兩者異常水平均獲改善，表明ED對(duì)認(rèn)知障礙小鼠的海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激有改善作用，可能是其提高學(xué)習(xí)記憶功能及促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生的基礎(chǔ)。

綜上，ED可改善認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，可能是通過(guò)降低氧化應(yīng)激及促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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