莊 嚴(yán) 王丹丹 柳忠蘭 王建華 曹亦賓

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 唐山 063000)

細(xì)胞凋亡途徑是缺血腦細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)之一。半脫氨酸蛋白酶(Caspases)家族是細(xì)胞凋亡程序中一類關(guān)鍵的同源半胱氨酸蛋白酶，Caspase-3是凋亡途徑中多種死亡受體介導(dǎo)過程共同的下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路〔1〕，本實驗以吸煙作為干預(yù)，參照Zea Longa線栓法〔2〕建立大鼠局灶性腦缺血模型，研究吸煙對腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Caspase-3的表達和對其活性的影響情況，分析探討吸煙對腦細(xì)胞缺血半暗帶轉(zhuǎn)歸結(jié)果和機制的影響。

1 資料與方法

1.1動物和試劑 雄性Wistar大鼠8周齡，SPF級，體重(265±15) g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。 四氮唑紅(TTC)：上海漢飛公司，原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒；兔抗大鼠Caspase-3 H-277：美國Santa Cruz公司；兔抗大鼠β-actin CH18-0054：美國ZY ED公司；香煙為國內(nèi)普通市售品牌，尼古丁和焦油含量分別為1.2、16 mg/支。

1.2動物分組 本實驗取篩選的60只健康的雄性Wistar大鼠，按照隨機平均原則分為四組：缺血對照組、假手術(shù)組、吸煙組以及吸煙+缺血組。

1.3吸煙動物模型制備 采用改良的Chow等建立的煙灌注模型的方法，首先制備吸煙鼠箱，主要應(yīng)用有機玻璃、角鋼以及部分鋼絲做成長60 cm，寬40 cm，高30 cm大小的鼠箱，然后在箱子的側(cè)面以及斜對兩側(cè)各打兩個直徑和間距均為1 cm的孔，其中一側(cè)的兩孔連接雙腔空氣泵，兩孔分別輸入空氣和煙霧；另一側(cè)的兩孔與外界相通，保證鼠箱與外界的氧濃度一樣。連續(xù)12 w給予吸煙組以及吸煙+缺血組的Wistar大鼠吸煙干預(yù)刺激，一般吸煙量為20支/d。缺血對照組和假手術(shù)組的Wistar大鼠除了無吸煙干預(yù)其余處理方法一樣。

1.4雄性Wistar大鼠大腦中動脈(MCA)栓塞模型(MCAO)的制備 主要是對缺血對照組和吸煙+缺血組的雄性Wistar大鼠建立MCAO模型，采用改良的Zea longa〔3〕的MCAO模型制備方法，具體步驟如下：采用氯胺酮(10 mg/kg)稀釋后進行腹腔注射麻醉，在Wistar大鼠頸部作正中切口，鈍性分離鼓泡腺，逐層暴露分離血管，主要有頸內(nèi)、外動脈和頸總動脈，結(jié)扎血管時首先在頸總動脈扎一個活結(jié)，然后把漁線插進頸總動脈分叉處，結(jié)扎頸總動脈；然后再用微血管夾臨時阻斷頸內(nèi)動脈的血液供應(yīng)，在頸總動脈分叉處剪一長0.3 mm的小口，把漁線緩慢插入頸內(nèi)動脈，有微阻感，一般深度達(18±0.5)mm，這時就表明漁線到達了Wistar大鼠MCA的起始端，對MCA的起始端進行結(jié)扎阻塞，同時頸內(nèi)動脈也用漁線進行結(jié)扎，完成后一般留出栓線外端1.5 cm左右，最后縫合皮膚。假手術(shù)組和吸煙組的Wistar大鼠漁線插入頸內(nèi)動脈的深度比另外兩組淺在15 mm左右。

1.5大鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀觀察 觀察MCAO模型制備完成后麻醉清醒后(大約4 h)其四肢的反應(yīng)及活動情況，作為篩選的依據(jù)。若不出現(xiàn)前肢伸展無力、行走不穩(wěn)、傾倒或轉(zhuǎn)圈以及四肢無力無法行走等癥狀，就要從實驗組中排除。

1.6TTC染色 制備篩選大鼠MCAO模型完成4 h，從每組隨機選取5只大鼠，利用斷頭法取出腦組織，將腦干和小腦去除后，放置在0℃的生理鹽水中10 min，再取出放置于-20℃的鋼板上，由后向前按照2 mm的層厚沿冠狀面進行切開，其切片要立即浸泡于含1%TTC的生理鹽水中，37℃下孵育30 min。然后再放入固定液(10%的甲醛)中，放置于室溫6 h，取出觀察。

1.7細(xì)胞凋亡的檢測 與TTC染色一樣，從制備好MCAO模型的每組隨機再選取5只大鼠，進行麻醉后，開胸，暴露心臟，找到右心耳剪開一小口，將直徑2 mm的膠管從左心室插入，快速灌注生理鹽水200 ml，觀察到右心耳有透亮液體流出，再用中性甲醛進行灌注固定30 min，然后利用斷頭法取出腦組織，再用中性甲醛將腦組織固定48 h后，常規(guī)行石蠟包埋，自距嗅球尖端7～11 mm處行石蠟切片，切片厚4 μm，行TUNEL染色，應(yīng)用Quantiment 570C圖像分析系統(tǒng)進行觀察，400倍鏡下每張切片隨機10處單位面積內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)，除以10得到的平均數(shù)，就是該標(biāo)本的凋亡細(xì)胞數(shù)目。

1.8Western印跡檢測大鼠腦內(nèi)Caspase-3原型及活性片段的表達 同樣MCAO后4 h，每組大鼠隨機選取5只大鼠，麻醉后斷頭，左右大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm處取材。每只大鼠取腦組織50 mg，制成腦組織勻漿，利用Brad-ford法進行蛋白定量分析。 分別從每組大鼠中取100 μg 10%+二苯硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和膜封閉后，兔抗大鼠Caspase-3 4℃過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，用二氨聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行顯色，可以觀察到特異性抗原條帶出現(xiàn)。再用凝膠成像分析系統(tǒng)對每例特異性抗原條帶進行定量分析測定，主要是Caspase-3的前體32 kD和切割片段20 kD的目的條帶及相應(yīng)β-actin 的43 kD條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組TTC染色結(jié)果 各組大鼠腦組織經(jīng)TTC染色后，觀察到缺血梗死區(qū)域的組織不染色，呈白色，主要分布在缺血中心區(qū)的等值區(qū)，分別是矢狀裂至外側(cè)裂下幾乎2/3的皮質(zhì)以及距嗅球尖端7～11 mm處；而正常腦組織被染成紅色；同時觀察到矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)區(qū)內(nèi)呈現(xiàn)白色向紅色的過渡，證實了缺血半暗帶主要位于大腦矢狀裂至外側(cè)裂上1/3的皮質(zhì)組織區(qū)。

2.2吸煙對Wistar大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)過TUNEL染色后經(jīng)Quantiment 570C圖像分析系統(tǒng)觀察凋亡細(xì)胞，染色后陽性細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色。缺血組、假手術(shù)組、吸煙組以及吸煙+缺血組的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為17.07±2.92、2.13±0.17、20.65±3.26、44.92±4.67；缺血組、吸煙組以及吸煙+缺血組的凋亡細(xì)胞數(shù)均比假手術(shù)組增加，其中吸煙+缺血組的凋亡細(xì)胞數(shù)增加更加顯著(P<0.05)；同時表明了吸煙和缺血對增加腦細(xì)胞的凋亡有協(xié)同作用。見圖1。

A:假手術(shù)組, B:缺血組, C:吸煙組, D:吸煙+缺血組。

2.3各組Caspase-3前體及其切割片段含量的Western印跡檢測 假手術(shù)組未檢測到Caspase-3的前體32 kD和切割片段20 kD的特異性條帶；缺血組、吸煙組和吸煙+缺血組均可檢測到Caspase-3前體和其切割片段的含量相對灰度值呈平行變化，且在吸煙干預(yù)因素協(xié)同下缺血后二者表達明顯升高(均P<0.05)。見表1，圖2。

表1 各組Caspase-3前體及其切割片段含量相對灰度值的比較

A:假手術(shù)組, B:缺血組, C:吸煙組, D:吸煙+缺血組

2.4線性相關(guān)分析 各組缺血半暗帶區(qū)內(nèi)Caspase-3前體32 kD和切割片段20 kD含量的相對灰度值與凋亡細(xì)胞數(shù)量這3種參數(shù)間呈顯著性正相關(guān)(r=0.902～0.970，P<0.01)。

3 討 論

近年來有研究表明局灶性腦缺血后神經(jīng)元的死亡主要表現(xiàn)在缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的壞死和缺血半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔4〕。相對于缺血中心區(qū)發(fā)生不可逆損傷的腦組織而言，缺血半暗帶的腦組織損傷為可逆性，可以進行修復(fù)，因此，人們設(shè)想及時采取有效的干預(yù)可能會防止缺血半暗帶向梗死區(qū)進一步發(fā)展，主要機制可能是通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本實驗通過建立短暫性MCAO大鼠模型來分析探討吸煙對局灶性腦缺血損傷的影響。結(jié)果證實吸煙增加大鼠腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量，且與上調(diào)相應(yīng)區(qū)域內(nèi)Caspase-3表達及活性有關(guān)，從而不利于腦缺血半暗帶的轉(zhuǎn)歸。

吸煙對腦細(xì)胞損傷的神經(jīng)破壞作用機制十分復(fù)雜，有研究表明吸煙增加血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附介子-1(ICAM-1)損傷，促進動脈硬化改變〔5〕。以往的研究提示吸煙能增加大鼠腦細(xì)胞凋亡〔6〕。本試驗結(jié)果表明了吸煙加重腦缺血損傷可能是通過協(xié)同缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機制介導(dǎo)的。

Caspases是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后實施是通過Caspases的激活而實現(xiàn)的， Caspase-3作為多種凋亡程序啟動最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶，有著非常重要的意義和作用〔7〕，主要是可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；尤其在缺血性腦損傷的過程中，抑制Caspase-3的活性可以產(chǎn)生較明顯的神經(jīng)保護作用〔8〕。Caspase-3是Caspases家族重要的成員，細(xì)胞內(nèi)的含量一般比較少，其通常以前體形式存在。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡途徑可以誘導(dǎo)上調(diào)Caspase-3前體的表達和活化水平〔9,10〕。本研究結(jié)果提示吸煙引起鼠腦缺血半暗帶區(qū)Caspase-3表達及活性異常增加，是缺血半暗帶區(qū)吸煙引發(fā)神經(jīng)元凋亡的重要分子機制，促使神經(jīng)元發(fā)生進行性損傷，從而加重腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

總之，吸煙可以增加MCAO后4 h缺血半暗帶區(qū)的細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)損傷作用不利于缺血半暗帶的轉(zhuǎn)歸。吸煙加重腦缺血損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用可能涉及腦內(nèi)Caspase-3表達及活性的增加，吸煙上調(diào)Caspase-3表達及活性的作用機制尚有待于進一步研究。

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