趙燕穎 李亞剛 趙春燕 楊澤成 張舵舵 孫遠(yuǎn)杰

(吉林大學(xué)第四臨床醫(yī)院內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130011)

肝癌存在多種原癌基因的激活和抑癌基因的失活、突變,最終導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)的改變,從而引起細(xì)胞惡變〔1〕。MDM2的基因產(chǎn)物可以和野生型p53(wtp53)結(jié)合，可以起到一種對(duì)p53的負(fù)調(diào)節(jié)作用，因?yàn)镸DM2基因的過度表達(dá)，可以減少p53基因的抑癌作用，即使是低水平MDM2的表達(dá)，也將會(huì)引起細(xì)胞成瘤性的增強(qiáng)〔2〕。目前已有大量研究表明在消化系統(tǒng)腫瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌中MDM2都是過渡表達(dá)的〔3〕。siRNA技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的一種公認(rèn)的有效工具,并且可以用于篩選藥物靶點(diǎn),為治療腫瘤、病毒感染帶來突破。目前尚未見用siRNA技術(shù)干擾MDM2表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞的報(bào)道。本文作者設(shè)計(jì)siRNA MDM2并轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響和對(duì)MDM2及其上下游基因蛋白的表達(dá)影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基 (Gibco);Trizol Reagent，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒(Invitrogen)、SilencerTMsiRNA construction kit(Ambion 公司);LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成；細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)。兔抗人MDM2、wtp53、p21、Bcl-2和β-actin抗體及羊抗兔二抗購于UPSTATE，Hybond 硝酸纖維素膜 (NC) 購自Amersham。

1.2siRNA 的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)已知Gen Bank MDM2 mRNA序列和siRNA的設(shè)計(jì)原則〔4〕,利用Ambion 公司的在線設(shè)計(jì)來尋找靶序列,并做同源序列搜索,排除那些和其他編碼序列或表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)同源的序列,用SilencerTMsiRNA construction kit體外合成siMDM2-1，siMDM2-2,陰性對(duì)照(control siRNA)購于Ambion,與任何編碼序列無同源性。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞所提供。在含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng),于5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用0.25 %胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,用細(xì)胞記數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。取96孔板和10 ml培養(yǎng)瓶。96孔板每個(gè)培養(yǎng)皿接種細(xì)胞數(shù)為1×104,培養(yǎng)瓶接種1×106，37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。做好分組標(biāo)志(Ⅰ組：PGCsilencerTM-MDM2 siRNA-1;Ⅱ組：PGCsilencerTM-MDM2 siRNA-2；Ⅲ組：PGCsilencerTM-control siRNA；Ⅳ組:只加轉(zhuǎn)染試劑lipofectin)。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書。

1.4RT-PCR檢測(cè)siMDM2對(duì)細(xì)胞基因的影響 轉(zhuǎn)染后72 h用Trizol 提取各組細(xì)胞中的總RNA。總RNA中逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,再通過PCR法擴(kuò)增，操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。以β-actin作為內(nèi)參，MDM2擴(kuò)增產(chǎn)物為300 bp，上游5′-AACCACCTCACAGATTCCAG-3′，下游5′-TCAAGGTGACACCTGTTCTC-3′；p53擴(kuò)增引物為490 bp，上游5′-GTGGTGGTGCCCTATGAG -3′；下游5′-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3′;P21擴(kuò)增產(chǎn)物為486 bp，上游5′-GCTGAGCCGCGACTGTGAT-3′下游5′-TGAGACTAAGGCAGAAGATGTA-3′；Bcl2擴(kuò)增產(chǎn)物為382 bp，上游5′-GACCGAAGTCCGCAGAAC-3′，下游5′-CCAACGTGCCATGTGCTA-3′;β-actin 擴(kuò)增產(chǎn)物為 520 bp，上游:5′-GGGACCTGACAGACTACCT-3′，下游：5′-CGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴乙啶)，拍照鑒定。用Pharmacia ImageMaster 凝膠成像儀觀察,并用 ImageMaster 軟件分析條帶峰面積,轉(zhuǎn)染各組信號(hào)值相對(duì)于對(duì)照組的百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

1.5MTT法檢測(cè)siMDM2對(duì)細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染siMDM-1、2和control siRNA,每組4復(fù)孔,培養(yǎng)24，48，72 h 后每孔加入5 g/ L MTT 溶液15 μl，37℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm測(cè)定各孔吸光度,記錄結(jié)果。以時(shí)間、吸光度繪制細(xì)胞增殖曲線,細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-處理組吸光度/未處理組吸光度)×100%,計(jì)算出抑制率。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)siMDM2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集各組的HepG2細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,70%冰乙醇固定,碘化丙啶染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過軟件Multicycle進(jìn)行分析,以DNA含量為橫坐標(biāo),受檢細(xì)胞為縱坐標(biāo)作圖,用累積曲線分割法計(jì)算各期細(xì)胞所占比例。G1峰前面出現(xiàn)的亞2倍體峰即為凋亡峰，計(jì)算各組凋亡率。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siMDM2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 將HepG2細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清(FBS)的IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。次日待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí),用中號(hào)槍頭進(jìn)行劃痕，PBS洗3次以去除劃下的細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡拍照紀(jì)錄。比較轉(zhuǎn)染前后劃痕寬度的變化。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定 PGCsilencerTM-MDM2 siRNA經(jīng)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后呈2條帶,分成大的載體片段和小的目的片段。將重組質(zhì)粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生工測(cè)序(測(cè)序號(hào)D02.CS060503093_0253.SD13D229-1.F；D04.CS060503093_0255.SD13D230-1.F),引物序列根據(jù)載體序列,采用Primer-Premier5.0設(shè)計(jì)為：5′-AAGAAGAGAGTGTGGAATCTA-3′。結(jié)果表明siRNA表達(dá)模板成功構(gòu)建于PGCsilencer載體上,序列完全正確,與目的序列相同。見圖1。

1:Marker;2:siMDM2-1;3:siMDM2-1/HindⅢ+BamHⅠ;4:siMDM2-2;5:siMDM2-2/HindⅢ+BamHⅠ;6:control siRNA;7：control siRNA / Hind Ⅲ+ BamH Ⅰ;8:Marker

2.2siMDM2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞基因表達(dá)的變化 以β-actin作為內(nèi)參照,對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行RT-PCR結(jié)果定性定量分析，各組引物的擴(kuò)增基因片段經(jīng)電泳和HE染色后,結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與所設(shè)計(jì)的大小完全一致。siMDM2-1，2對(duì)基因表達(dá)影響趨勢(shì)一致，轉(zhuǎn)染2組siMDM2后MDM2和Bcl2 mRNA表達(dá)水平有顯著的下調(diào),p53和p21 mRNA表達(dá)水平有顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組各基因表達(dá)水平無明顯改變。半定量掃描分析,和空白組比較轉(zhuǎn)染2組si-MDM2的HepG2中MDM2 mRNA的表達(dá)量平均下調(diào)61.7%;p53 mRNA表達(dá)量平均上調(diào)46.9%；p21 mRNA表達(dá)量平均上調(diào)41.8%；Bcl2 mRNA平均下調(diào)39.5%，和空白組比均具有顯著性差異(P<0.05,n=4)； control siRNA組各基因表達(dá)量與空白對(duì)照組無明顯差異(P>0.05,n=4)。見圖2。

2.3siMDM2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖的變化 MTT法檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染siMDM2后HepG2細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，轉(zhuǎn)染2組si MDM2后24、48、72 h的平均抑制率為(30.9±2.99)%、(45.6±3.15)%和(52.1±3.29)%。抑制率隨時(shí)間的增加而增高，各轉(zhuǎn)染組抑制率明顯高于control siRNA組，control siRNA組細(xì)胞增殖未見明顯改變。而且siMDM2-1組抑制率稍高于siMDM2-2組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4siMDM2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的變化 轉(zhuǎn)染siMDM2可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染2組siMDM2的細(xì)胞凋亡率分別為(41.9±2.59)%和(34.9±1.98)%，明顯高于control siRNA組(2.6±0.39)%(P<0.05)。同時(shí)，和空白組比siMDM2組細(xì)胞處于S期的細(xì)胞比例明顯減少;而處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增加。

2.5siMDM2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的變化 control組與control siRNA組遷移較快，而siMDM2組遷移速率變慢，control組與control siRNA組之間差異無顯著性(P>0.05)，各組siMDM2之間差異無顯著性(P>0.05)。siMDM2組遷移距離與空白組和control siRNA組相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組MDM2、P53、P21和Bcl2基因表達(dá)的變化

圖3 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞遷移能力的變化

3 討 論

目前原癌基因、抑癌基因、凋亡基因等癌癥相關(guān)基因的過度表達(dá)被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的主要原因。一些研究表明，可以用RNAi技術(shù)抑制原癌基因，突變的抑癌基因，細(xì)胞周期相關(guān)基因，抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)來抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展〔1〕。肝癌的發(fā)生是多基因參與的結(jié)果，隨著肝癌分子機(jī)制研究的不斷深入，可成為RNAi技術(shù)靶位點(diǎn)的基因也越來越多，因此，如能利用RNAi技術(shù)抑制癌基因的表達(dá)，從而影響上下游基因表達(dá)變化，就可能抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

MDM2作為一種癌基因,其生物學(xué)作用是增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活力,使細(xì)胞生存期延長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞增生及腫瘤的生長(zhǎng)〔5〕。MDM2能與p53結(jié)合,抑制p53的抑癌功能。p53和Bcl-2同屬于細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程中有相互聯(lián)系、共同作用的關(guān)系〔6〕。Farah等〔7〕認(rèn)為p53基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為：降低細(xì)胞內(nèi)源性Bcl-2蛋白表達(dá)和抑制其功能,p53基因與Bcl-2蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。另外，MDM2蛋白還可以與p21結(jié)合,終止p21被p53活化的抑制細(xì)胞增生的作用〔8，9〕。P21是ras基因家族中一種共同表達(dá)產(chǎn)物,是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控基因,可被野生型p53蛋白誘導(dǎo)表達(dá)而使細(xì)胞周期停滯于G1期。MDM2過表達(dá)可以下調(diào)p53和p21表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而刺激細(xì)胞無限制性生長(zhǎng),這可能在某些腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起著關(guān)健性作用。

本文結(jié)果顯示siMDM2可抑制MDM2基因的表達(dá)從而促進(jìn)p53表達(dá)，最終導(dǎo)致p21表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)降低，這可能是siMDM2抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的主要機(jī)制之一。

本課題組在siRNA MDM2對(duì)前列腺癌增殖和凋亡的影響研究基礎(chǔ)上〔10〕，對(duì)干擾MDM2在肝癌治療中作用的進(jìn)一步研究。研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了本研究組設(shè)計(jì)合成的siRNA MDM2質(zhì)粒可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。siRNA技術(shù)為腫瘤基因治療提供了一個(gè)新的可供選擇的策略和技術(shù)平臺(tái),本研究亦表明MDM2可能是腫瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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