梁 濤 瞿凌晨 趙曉莉 梁 衛(wèi) 呂高虹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，江蘇 南京 210023)

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)最常見的并發(fā)癥之一,幾乎所有SLE均有不同程度腎臟病變〔1〕。LN的發(fā)病機(jī)制目前一般認(rèn)為是由于自身免疫功能紊亂,產(chǎn)生大量抗體,形成的免疫復(fù)合物沉積在腎小球基底膜和毛細(xì)血管壁，引起腎臟損傷〔2〕。本文研究的狼瘡清顆粒是從《備急千金要方》所載的犀角地黃湯中而來(lái)，具有清熱解毒、涼血化瘀、滋養(yǎng)陰液功效，本實(shí)驗(yàn)擬研究其對(duì)LN是否具有治療作用,以期為狼瘡顆粒治療狼瘡腎炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 狼瘡清顆粒：南京中醫(yī)藥大學(xué)提供,批號(hào)100726；潑尼松：天津藥業(yè)公司，批號(hào)：100309；弗氏完全佐劑:均為美國(guó)Sigma公司；尿蛋白、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)試劑盒：由南京建成生物有限公司提供；NF-κBp65一抗小鼠來(lái)源：Santa cruz提供；全蛋白抽提試劑盒,麗春紅染色液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,一抗稀釋液，二抗稀釋液，內(nèi)參一抗(β-actin一抗來(lái)源兔)，ECL檢測(cè)試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)蛋白試劑盒均為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MRL/lpr小鼠、C57BL/6J小鼠：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2007-004。Wistar大鼠由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2002-0053；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2002-0012。

1.3儀器 Western電泳儀：Bio-Rad，America；高速冷凍離心機(jī),美國(guó)科俊儀器公司；低溫冰箱：Sanyo，Japan；電熱恒溫干燥箱：上海潤(rùn)東榮豐科學(xué)儀器有限公司；振蕩器：上海滬西分析儀器廠；多用脫色搖床：江蘇金壇市正基儀器廠；微量加樣器：Eppendorf；pH計(jì)：梅特勒-托麗多儀器公司；SyneRgy HT酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek。

1.4狼瘡清顆粒對(duì)主動(dòng)型Heymann腎炎(AHN)大鼠模型腎功能影響

1.4.1抗原制備 取體重(150±20) g的Wistar大鼠,雌雄兼有,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,在無(wú)菌條件下剖開腹腔,結(jié)扎腎動(dòng)脈,自結(jié)扎處向腎臟插管,剪斷腎靜脈,經(jīng)插管用生理鹽水反復(fù)沖洗腎臟，使之成灰白色,取下腎臟,取腎皮質(zhì)用電動(dòng)勻漿器磨成勻漿,每次取皮質(zhì)勻漿35 g,加弗氏完全佐劑70 ml,置乳缽研勻,緩緩加入生理鹽水140 ml邊加邊磨,使乳化均勻完全。

1.4.2模型制作 取體重(150±15) g的雄性Wistar大鼠，放入大鼠代謝籠中(每籠1只),收集24 h尿蛋白總量,除隨機(jī)抽取10只作正常對(duì)照組(正常組)外,其余大鼠腹腔注射上述同種大鼠腎皮質(zhì)加弗氏完全佐劑液,每次2 ml/只,每2 w注射1次,共造模12 w,前后共注射7次,同時(shí)肌注硫酸慶大霉素注射液以預(yù)防感染。并于造模第8周同法收集24 h尿液,測(cè)定24 h尿蛋白。

1.4.3分組方法 取24 h尿蛋白量在20.07～41.37 mg之間的造模大鼠40只,按尿蛋白水平分層后隨機(jī)分為4組：模型組：給予其他組等體積蒸餾水；狼瘡清顆粒(中藥)組：給予狼瘡清顆粒(22.8 g/kg),狼瘡清顆粒+潑尼松(中藥+西藥)組：給予狼瘡清顆粒+潑尼松(22.8+0.005) g/kg，潑尼松(西藥)組：給予潑尼松(0.005 g/kg)。10只同批大鼠作為正常組給予等體積蒸餾水。灌胃連續(xù)4 w。

1.4.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 ①尿蛋白、尿素氮、肌酐檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束,代謝籠收集24 h尿液，測(cè)定尿蛋白，眼眶取血，離心，收集血清，酶標(biāo)儀測(cè)定BUN,Cr。②腎臟組織病理學(xué)觀察：大鼠處死后,取出腎臟,經(jīng)腎門最大面切取1/2腎臟,10%甲醛固定,逐級(jí)酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋,常規(guī)切片4 μm,PAS染色,Mias22000圖像分析儀分析。腎小球毛細(xì)血管壁厚度:隨機(jī)選擇 PAS染色腎小球數(shù)15個(gè),觀察毛細(xì)血管壁厚度。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:(-)血管壁厚度沒有增加;(+)血管壁厚度增加數(shù)占總量的0%～25%;()血管壁厚度增加數(shù)占總量的26%～50%;()變性占總量的51%～75%;()變性占總量的76%～100%。

1.5對(duì)狼瘡性MRL/lpr小鼠NF-κBp65蛋白的表達(dá)的影響

1.5.1試驗(yàn)方法及分組 取MRL/lpr小鼠20只，雌性，8周齡，飼養(yǎng)至90日齡，隨機(jī)分成4組，每組5只:模型組：MRL/lpr小鼠給予蒸餾水；狼瘡清顆粒(中藥)組：MRL/lpr小鼠給予狼瘡清顆粒(45.6 g/kg)；潑尼松(西藥)組：MRL/lpr小鼠給予潑尼松(0.01 g/kg)；狼瘡清顆粒+潑尼松(中藥組+西藥)組：MRL/lpr小鼠給予狼瘡清顆粒(45.6 g/kg)+潑尼松(0.01 g/kg)。正常對(duì)照組：C57BL/6J小鼠5只，給予蒸餾水。灌胃給藥,給藥體積0.1 ml/10 g,連續(xù)4 w。

1.5.2Western印跡檢測(cè)腎組織NF-κBp65蛋白的表達(dá) 灌胃給藥4周末將小鼠脫臼處死,迅速取出腎臟待測(cè)。采用Western 印跡的方法，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,步驟參照文獻(xiàn)。麗春紅染色顯示凝膠中的蛋白條帶后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行NF-κBp65蛋白的檢測(cè)。一抗NF-κBp65小鼠多克隆抗體(1∶200)和β-actin(1∶200)，二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記抗體,山羊抗小鼠多克隆抗體1∶5 000稀釋)。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,顯影定影水洗晾干后,對(duì)膠片感光條帶進(jìn)行灰度掃描。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析軟件對(duì)Western印跡雜交條帶進(jìn)行密度掃描，以NF-κBp65條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示組織中NF-κBp65表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)主動(dòng)型 Heymann腎炎(AHN)大鼠腎功能影響 狼瘡清顆粒組、狼瘡清顆粒+潑尼松組、潑尼松組的BUN、Cr和尿蛋白水平均顯著低于模型組(P<0.05)，同時(shí)病理結(jié)果顯示：各給藥組大鼠腎小球毛細(xì)血管壁厚度、腎小管變性、與模型組大鼠相比均有不同程度的改善。見表1、表2。

表1 對(duì)主動(dòng)型 Heymann腎炎(AHN)大鼠腎功能的作用

表2 AHN大鼠腎臟病理學(xué)觀察結(jié)果(n, n=10)

2.2對(duì)狼瘡樣MRL/lpr小鼠腎組織 NF-κBp65蛋白的影響 正常組NF-κBp65蛋白的表達(dá)(2.36±0.073 7),模型組(6.25±0.062 8)顯著增加(P<0.01)；與模型組相比較,狼瘡清顆粒組(4.30±0.059 1)、潑尼松組(4.17±0.042 9)、狼瘡清顆粒+潑尼松組(2.56±0.052 8)、NF-κBp65蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01),其中狼瘡清顆粒與潑尼松合用NF-κBp65蛋白表達(dá)下降最明顯。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給藥后各組降低24 h尿蛋白、血清BUN、Cr的含量。而24 h尿蛋白、血清Cr、BUN是衡量腎功能的重要指標(biāo)，蛋白尿的輕重反映了腎小球基底膜的病變程度，另外腎臟病變時(shí)尿中異常出現(xiàn)的蛋白本身可能造成腎臟的損害,加重腎間質(zhì)的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)其纖維化〔3〕。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損害時(shí),腎小球?yàn)V過率降低后,血中Cr、BUN含量就會(huì)急劇上升，作為腎小球?yàn)V過功能和腎損傷的指標(biāo)之一〔4〕。本結(jié)果提示我們狼瘡清顆粒具有改善AHN腎炎模型大鼠腎功能的作用。

NF-κB最初是從B淋巴細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κ鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合的蛋白因子，最常見的形式是p65和p50蛋白亞基組成的二聚體,它廣泛參與許多基因(特別是免疫炎癥相關(guān)基因)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,包括白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、ICAM-1、IL-6、IL-15等細(xì)胞因子基因的表達(dá),從而在免疫炎癥的病理過程中起重要作用〔5，6〕。近年來(lái),對(duì)NF-κB在炎癥和免疫性疾病中的作用及相關(guān)藥物的作用機(jī)制研究成為抗炎免疫藥理學(xué)的一大熱門領(lǐng)域〔7〕。有研究表明〔8〕:NF-κB與狼瘡腎炎活動(dòng)有密切聯(lián)系,可能參與了狼瘡腎炎的發(fā)病機(jī)制。因此,抑制NF-κB的過度活化很可能成為治療SLE分子機(jī)制的一個(gè)較好的靶點(diǎn)。本研究顯示:狼瘡清顆粒能抑制狼瘡小鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)，可能是其治療狼瘡性腎病的機(jī)制之一。

4 參考文獻(xiàn)

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5Makarov SS.NF-κB as a therapeutic target in chronic inflammation：recent advances〔J〕.Molecul Med Today，2000;6:441-9.

6Pahl HL.Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors〔J〕.Oncogene,1999;18:6853-8.

7向 明,吳 鐳,劉 屏.我國(guó)抗炎免疫藥理學(xué)研究的重要領(lǐng)域和發(fā)展趨勢(shì)〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003;19(2):138-9.

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