閆恩志 范 瑩 隋海娟 劉婉珠 劉 卓

(遼寧醫(yī)學院藥理學教研室， 遼寧 錦州 121001)

阿爾茨海默癥(AD)具有多重的神經(jīng)病理學特征，如老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和明顯的膠質(zhì)化〔1〕，其發(fā)病機制復雜，作用單一靶點的藥物很難達到治療效果。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是哺乳動物細胞重要的應(yīng)激信號傳導通路，AD患者腦內(nèi)JNK信號傳導通路的激活已被學者廣泛證實〔2〕，近年來體內(nèi)、體外的研究中發(fā)現(xiàn)JNK信號傳導通路的激活參與著淀粉樣蛋白沉積〔3〕、tau蛋白磷酸化〔4〕和神經(jīng)細胞凋亡〔5〕，JNK信號傳導通路在AD中具有多重靶點的調(diào)節(jié)作用，因此尋找作用于JNK信號傳導通路的特效藥物有望在AD治療中取得突破性進展。阿魏酸鈉(SF)具有抗氧化、抗自由基及抗炎等藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)SF能減輕脂多糖誘導的大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷，改善大鼠的學習記憶障礙，本研究旨在探討SF是否通過JNK信號傳導通路抑制大鼠海馬CA1區(qū)炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1動物藥品和試劑 SD大鼠，雄性，體重220～280 g，動物合格證號：SCXK(遼)2003-0007，由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供。SF(蘇州暢通有限公司，純度大于99 %)；LPS購于北京邦定泰克生物技術(shù)公司(純度95%)；磷酸化絲裂原激活的蛋白激酶的激酶4(MKK4；Thr261，#9151)，磷酸化JNK1 (Thr183/Tyr185，#9251)，磷酸化c-Jun (Ser63，#9261)，caspase-3(#9662)均為兔抗人多克隆抗體，購于Cell Signaling公司；OX-42為鼠抗人多克隆抗體、FITC標記的山羊抗兔抗體和Cy3標記的山羊抗鼠抗體均購于Santa Cruz生物技術(shù)公司；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔抗體、β-actin和NBT/BCIP顯色液購于碧云天試劑公司。

1.2動物分組及模型建立 SD大鼠隨機分為四組，即對照組，LPS模型組，100，200 mg/kg SF組。對照組和模型組分別ig生理鹽水1.0 ml，SF組ig不同劑量SF1.0 ml。連續(xù)灌胃3 w后，各組大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，將大鼠頭固定在立體定位儀上，大鼠麻醉固定在立體定位儀上，無菌條件下將5 μl LPS 1.0 mmol/L恒速注射到左側(cè)腦室內(nèi)，正常對照組注射等量的生理鹽水。

1.3Western 蛋白印跡檢測磷酸化的MKK4、磷酸化JNK1、磷酸化c-Jun和caspase-3蛋白表達水平 大鼠麻醉，快速取海馬CA1區(qū)，按前述方法進行磷酸化蛋白測定〔6〕，簡言之，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，加入一抗4℃過夜，二抗孵育2 h(所有抗體均1∶500稀釋)，避光顯色，利用凝膠自動分析成像軟件Chem Image 5500對蛋白帶進行灰度值分析。

1.4激光共聚焦顯微鏡觀察磷酸化JNK1在小膠質(zhì)細胞表達部位 制備鼠腦石蠟切片，按前述方法進行p-JNK和OX-42熒光免疫組織化學雙染〔6〕，水溶性封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察，其中綠色熒光的分布和強度反映JNK的定位和表達強度，紅色熒光則反映代表小膠質(zhì)細胞的小膠質(zhì)細胞特異表達補體C3受體單克隆抗體(OX-42)的表達情況。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5軟件包進行ANOVA和LSD′s post hoc test檢驗。

2 結(jié) 果

2.1SF對LPS引起的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化MKK4表達水平的影響 側(cè)腦室注射LPS后,大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化MKK4蛋白表達水平較生理鹽水對照組明顯增加。 SF(100，200 mg/kg)可明顯對抗LPS引起的磷酸化MKK4蛋白表達水平增加(表1)。

2.2阿魏酸鈉對LPS引起的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化JNK1表達水平的影響 側(cè)腦室注射LPS 1 w后,大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化JNK1蛋白表達水平較生理鹽水對照組明顯增加。SF(100，200 mg/kg)可明顯對抗LPS引起的磷酸化JNK1蛋白表達水平增加(圖1和表1)。激光共聚焦顯微鏡進行觀察，磷酸化的JNK表達與表示小膠質(zhì)細胞的OX-42基本重疊(黃色)，說明磷酸化的JNK主要在小膠質(zhì)細胞內(nèi)表達(圖2，表1)。

2.3阿魏酸鈉對LPS引起的大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化c-Jun表達水平的影響 側(cè)腦室注射LPS 1 w后,大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化c-Jun蛋白表達水平較生理鹽水對照組明顯增加。 SF(100，200 mg/kg)可明顯對抗LPS引起的磷酸化c-Jun蛋白表達水平增加(P<0.05)(圖3和表1)。

2.4阿魏酸鈉對LPS引起的大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白表達水平的影響 側(cè)腦室注射LPS 1 w后,大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白表達水平較生理鹽水對照組明顯增加，SF(100，200 mg/kg)可明顯對抗LPS引起的caspase-3蛋白表達水平增加(圖4和表1)。

表1 SF對LPS引起的大鼠海馬CA1區(qū)p-MKK4、p-JNK1、p-c-Jun和caspase-3蛋白表達灰度值分析結(jié)果

1.對照組；2.模型組；3.SF 100 mg/kg組；4.SF 200 mg/kg組

圖2 激光共聚焦顯微鏡定位大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化JNK和OX-42在小膠質(zhì)細胞表達

1.對照組；2.模型組；3.SF 100 mg/kg組；4.SF 200 mg/kg組

1.對照組；2.模型組；3.SF 100 mg/kg組；4.SF 200 mg/kg組

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)腦室注射LPS后大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化JNK，c-Jun表達增加，同時JNK通路上游磷酸化MKK4表達也明顯增加，激光共聚焦顯示JNK的表達部位主要是在小膠質(zhì)細胞，說明JNK通路在小膠質(zhì)細胞活化介導的神經(jīng)細胞凋亡中可能起著主要作用。MKK4在上游激酶作用下激活，活化的MKK4進一步磷酸化JNK分子的絲氨酸殘基位點，活化JNK〔7〕。JNK是位于胞質(zhì)分子量為54KU的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它的雙磷酸化功能區(qū)Thr-Pro-Tyr與c-Jun N端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化從而使其活化并轉(zhuǎn)移到細胞核，引起級聯(lián)反應(yīng)，導致其一些底物相應(yīng)激活〔8，9〕。JNK激活后可通過兩種途徑發(fā)揮作用，一是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白的表達：JNK通過磷酸化c-Jun，活化的c-Jun可以聚合成類二聚體或與c-Fos 聚合成異二聚體，形成活化蛋白-1(AP-1)復合物，使c-Jun轉(zhuǎn)錄活性增強〔10〕，促進腫瘤壞死因子(TNF)α、白細胞介素(IL)-1β、iNOS、COX-2等炎癥因子表達〔11，12〕。另一方面是參與線粒體介導的細胞凋亡通路，通過改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的通透性釋放細胞色素C，進而活化促凋亡因子Apaf-1，促發(fā)caspase-9，caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，Caspase-3 是caspase家族的重要成員之一，是凋亡執(zhí)行的最終效應(yīng)因子，活化的caspase-3可以裂解很多靶蛋白，使細胞內(nèi)一些重要的生理過程發(fā)生障礙、細胞器的一些結(jié)構(gòu)成分崩解。本研究也發(fā)現(xiàn)LPS在上調(diào)JNK通路的同時也促進了磷酸化的caspase-3蛋白表達，而SF不僅能明顯抑制LPS引起的磷酸化MKK4，JNK，c-Jun表達增加，也能明顯抑制caspase-3蛋白表達增加，提示SF可能通過抑制JNK信號傳導通路起到抗細胞凋亡的作用。

JNK信號傳導通路除了參與AD腦內(nèi)的炎癥病變，還參與老年斑及神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成〔13〕，有研究顯示神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成過程與AD患者的癡呆嚴重程度相關(guān)，我們的實驗僅證明了SF通過抑制JNK信號傳導通路抗細胞凋亡的作用，SF是否還存在其他抗AD作用機制還需進一步研究。

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