周忠笑 魏晰麟 姚建茹 張 健 邊 剛 李金暉

(沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院普外三科，遼寧 沈陽 110024)

結(jié)直腸癌是世界上高發(fā)惡性腫瘤之一，多半起源于腺瘤,但是其發(fā)生的分子機(jī)制尚不十分清楚〔1〕。HDPR1基因以及其同系物參與胚胎生長和發(fā)育的調(diào)控〔2,3〕。然而關(guān)于HDPR1在人類疾病中所發(fā)揮的作用知之甚少。生物信息學(xué)分析顯示HDPR1mRNA的表達(dá)存在于羊膜、胎兒腦、眼睛、心臟、成人腦脊髓、胃印戒細(xì)胞癌、RER陽性結(jié)腸癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、軟骨肉瘤等〔4〕。目前認(rèn)為HDPR1基因是一個(gè)潛在的腫瘤相關(guān)基因〔5〕。然而，HDPR1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)模式和功能機(jī)制尚未闡明清楚。本研究通過檢測HDPR1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，以及探討HDPR1的表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞系的遷徙和侵襲的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸腺癌瘤株HCT-116為本實(shí)驗(yàn)室保存。用含有10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的McCoy's 5A培養(yǎng)液(購自SIGMA)，在37℃ 含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2siRNA轉(zhuǎn)染 使用HDPRl siRNA(Santa Cruz，USA)和陰性對照contol siRNA(Santa Cruz，USA)用特異性siRNA轉(zhuǎn)染試劑(Santa Cruz，USA) 按說明書推薦比例轉(zhuǎn)染至相應(yīng)細(xì)胞，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)PCR檢測。

1.3實(shí)時(shí)PCR 應(yīng)用Trizol (QIAGEN，德國)從組織或者細(xì)胞系里抽提總RNA。使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物(Takara)將總RNA合成cDNA。HDPR1進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的上游引物：5'-AAAGGGCTTCTGAGGAACGG-3'和下游： 5'- TCAGAGAAGGTATCCCGCCA-3' 為 (124 bp,1155-1278,NM_001079520.1)，以及GAPDH的實(shí)時(shí)PCR上游引物：5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3'和下游：5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'為(158 bp,376-533,NM_001256799.1)。實(shí)時(shí)PCR過程按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒(Takara)的說明書進(jìn)行。

1.4Western蛋白印跡雜交 利用RIPA裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒(Pierce)蛋白定量后取100 μg蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond膜(Amersham，德國)上，用5%脫脂奶粉(含0.1%Tween20的TBS即TBST配制)室溫封閉2 h。一抗HDPR1抗體(sigma，美國；1∶1 000)孵育4℃過夜，TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記到羊抗兔-IgG(DAKO；1∶1000)于室溫孵育2 h。通過Amersham ECL-Plus(德國)反應(yīng)后X光片曝光。

1.5細(xì)胞遷移能力的檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，取各組細(xì)胞，用胰酶消化后，用無血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取0.4 ml細(xì)胞懸液接種于Transwell小室(購自BD Bioscience)上層，下層加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，取出小室隔膜，用棉簽擦掉上面未穿過膜的細(xì)胞，風(fēng)干后用100%甲醇固定，吉姆薩染料染色， 在倒置顯微鏡下觀察拍照、計(jì)數(shù)。隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)并計(jì)算均值，試驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.6細(xì)胞侵襲能力的檢測 將基質(zhì)膠matrigel(購自BD Bioscience) 按1∶8 的比例用無血清McCoy's 5A稀釋后，取35 μl包被小室的上室，紫外燈照射過夜，其余步驟同遷徙實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HDPR1在人的直結(jié)腸癌中過表達(dá) HDPR1 mRNA的水平(1.54±0.33)與相應(yīng)的癌旁黏膜(1.0)比較在直結(jié)腸癌樣本中明顯升高(P<0.05)。應(yīng)用Western印跡進(jìn)一步證實(shí)高水平的HDPR1蛋白表達(dá)出現(xiàn)在直結(jié)腸癌中(P<0.05)。見圖1。

N：癌旁正常黏膜組織；C：直結(jié)腸癌組織

2.2HDPR1 siRNA沉默內(nèi)源性HDPR1表達(dá) 通過在HCT116轉(zhuǎn)染HDPR1 siRNA，沉默內(nèi)源性HDPR1表達(dá)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示48 h后HDPR1 siRNA轉(zhuǎn)染組，HDPR1 mRNA水平較陰性對照明顯降低〔(0.232±0.079) vs (1.035±0.088)，P<0.05〕，以空白對照為1。

2.3DHPR1 siRNA對HCT116細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，HDPR1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(15.765±2.0)明顯低于陰性對照組(49.5±4.0)和HCT116(空白對照)組(50.099±5.8)(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后，HCT116(空白對照)細(xì)胞數(shù)為23.76； Mock(陰性對照)細(xì)胞數(shù)為22.098 7； HDPR1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)為5.876 5；可見HDPR1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(5.88±1.0)明顯低于陰性對照組(22.09±2.68)和空白對照組(23.16±3.89)(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

HDPR1是Dapper家族的成員，是Wnt通路重要的調(diào)控因子〔8〕。HDPR1在結(jié)直腸癌中也可能起到重要的作用。HDPR1在侵襲的乳腺癌中上調(diào)〔9〕，以及HDPR1在食管癌中高表達(dá)并且與臨床病理因素相關(guān)，免疫組化顯示胞漿中高表達(dá)的HDPR1與局部的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度成正相關(guān)。這些研究與我們的研究結(jié)果HDPR1在人的直結(jié)腸癌中高表達(dá)一致。然而，也有文獻(xiàn)報(bào)道〔5～7〕HDPR1在肝細(xì)胞癌和肺癌中表達(dá)下調(diào)，與本研究趨勢相反。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HDPR1的高表達(dá)可以增強(qiáng)HCT116的遷徙和侵襲能力。與在肺癌細(xì)胞中HDPRl的表達(dá)下調(diào)可通過下調(diào)p120ctn蛋白分子的穩(wěn)定性和(或)間接上調(diào)β-catenin的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲能力的結(jié)論也相反〔7〕。以上研究均提示HDPR1發(fā)揮作用可能依賴于細(xì)胞所處的環(huán)境。

綜上，HDPR1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并且可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116的遷徙和侵襲。HDPR1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還有待于更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索，但隨著該研究的深入，將有利于揭示結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并尋找可能的防治靶點(diǎn)，從而進(jìn)行相關(guān)的基因治療。

4 參考文獻(xiàn)

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