曹 華 馬紅英 曹 霞 黃新莉 張雪靜 周曉紅

(河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091)

近年來肺纖維化的發(fā)病呈上升趨勢，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床上缺乏有效的治療方案，預(yù)后較差。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明內(nèi)源性硫化氫(H2S)的減少參與了脂多糖所致大鼠急性肺損傷的發(fā)病，而一定量的外源性H2S可通過本身的抗炎、抗氧化作用以及下調(diào)NO/iNOS體系、上調(diào) CO/HO-1體系發(fā)揮一定的抗損傷作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)觀察羥脯氨酸(HYP)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1及結(jié)締組織生長因子(CTGF)在大鼠肺纖維化過程中各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況，并研究外源性H2S對大鼠肺纖維化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 博萊霉素(BLM)A5購自天津太河制藥有限公司，羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司，TGF-β1及CTGF免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

1.2大鼠肺纖維化模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)〔2〕，以10%的水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于大鼠實(shí)驗(yàn)臺上，無菌條件下行頸部正中切口，逐層分離，暴露氣管，對照組一次性氣管內(nèi)注入生理鹽水1 ml/kg，其余組一次性氣管內(nèi)注入等體積BLM 5 mg/kg，注射后即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)均勻分布，爾后縫合皮膚，置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)喂養(yǎng)。

1.3動(dòng)物分組和給藥 清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體重230～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為3組，每組18只。對照組、肺纖維化組和NaHS(H2S供體)+肺纖維化組。造模后第2天開始：NaHS+肺纖維化組每天腹腔注射0.5 ml NaHS(28 μmol/kg)，對照組及肺纖維化組每天腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.4標(biāo)本制備 各組在給藥后7、14、28 d分別隨機(jī)從頸動(dòng)脈放血處死6只，留取左肺組織，以體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，供免疫組化用。取右肺組織100 mg制備10%肺組織勻漿，-70℃保存，用以檢測HYP含量。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1肺組織HYP含量的檢測 采用堿水解法，通過721分光光度計(jì)比色法測得，結(jié)果以每克肺組織中HYP的質(zhì)量表示。

1.5.2肺組織TGF-β1及CTGF蛋白測定 嚴(yán)格按照免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。于普通光鏡下觀察，胞質(zhì)呈清晰棕色為陽性，采用美國Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，自動(dòng)選取陽性區(qū)域并計(jì)算平均光密度值(A)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織HYP含量的比較 與對照組相比，肺纖維化組大鼠肺組織HYP 7 d時(shí)開始升高，且在 14、28 d繼續(xù)升高(P<0.01)；與肺纖維化組相比，NaHS+肺纖維化各組肺組織HYP在各期均顯著降低(P<0.01)，但各期HYP含量均高于同期對照組(P<0.05、0.01)，見表1。

2.2肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)比較 TGF-β1在對照組大鼠肺組織內(nèi)廣泛表達(dá)于氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等各種組織細(xì)胞及肺間質(zhì)內(nèi)。灌注BLM后TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，7 d達(dá)到高峰，以后表達(dá)逐漸降低，28 d表達(dá)仍高于對照組(P<0.01)。外源性H2S治療后各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1表達(dá)均較同期肺纖維化組減少(P<0.01)，但仍高于同期對照組(P<0.01)，見表2。

表1 三組大鼠各期HYP含量比較

表2 三組大鼠各時(shí)期肺組織中TGF-β1蛋白含量的比較(A值)

2.3肺組織CTGF蛋白表達(dá)比較 對照組CTGF陽性表達(dá)較少，主要表達(dá)于氣管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，肺間質(zhì)細(xì)胞未見表達(dá)。 肺纖維化組，CTGF同時(shí)也在肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞胞質(zhì)、成纖維細(xì)胞表達(dá)，陽性表達(dá)較對照組明顯升高，7 d達(dá)到高峰，以后表達(dá)逐漸降低，28 d表達(dá)仍高于對照組(P<0.01)。NaHS+肺纖維化組中各期CTGF陽性表達(dá)均較肺纖維化組明顯減少，但仍高于同期對照組(P<0.01)，見表3。

表3 三組大鼠各時(shí)期肺組織中CTGF蛋白含量的比較(A值)

2.5相關(guān)分析 將各組各時(shí)期TGF-β1與CTGF進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示二者均呈顯著正相關(guān)(r=0.891～0.968，P均<0.01)。

3 討 論

肺纖維化是多種原因?qū)е碌膰?yán)重肺損傷的共同結(jié)局，主要病理特點(diǎn)是早期的彌漫性肺泡炎和晚期大量成纖維細(xì)胞病理性增生及基質(zhì)膠原進(jìn)行性積聚并取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)。是一種難治的肺部疾病，目前公認(rèn)療效確切的糖皮質(zhì)激素，在肺泡炎期奏效，但在廣泛肺纖維化期則難有改觀，由于其副作用大〔3〕，且糖皮質(zhì)激素治療不能改變肺纖維化患者的生存期〔4〕，故其應(yīng)用有一定局限性。BLM是臨床常用的一種抗腫瘤藥物，其主要的毒副作用之一是引起肺纖維化，用其復(fù)制動(dòng)物肺纖維化模型，已成為國內(nèi)外公認(rèn)的成熟方法〔5〕。近年來，H2S作為體內(nèi)氣體信號分子逐漸成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)，雖然高濃度H2S對于機(jī)體是有害的，但是低濃度H2S卻在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，大量體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)H2S具有抗氧化、抑制炎癥因子釋放、抗增殖、抗凋亡、調(diào)節(jié)血管張力等生物學(xué)作用〔6〕。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用NaHS作為外源性H2S來源，進(jìn)一步觀察外源性H2S對于BLM致大鼠肺纖維化的作用機(jī)制。

HYP是膠原蛋白的主要成分之一，HYP含量的測定可以間接反映膠原含量，因此，測定HYP的含量常被用于肺纖維化的研究〔7〕。本實(shí)驗(yàn)研究提示肺纖維化模型復(fù)制成功；在大鼠肺纖維化的各個(gè)時(shí)期，應(yīng)用NaHS可通過參與調(diào)節(jié)肺組織中膠原的代謝，減輕膠原在肺間質(zhì)中的沉積，明顯改善肺組織病理變化，延緩肺纖維化發(fā)生與發(fā)展。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在介導(dǎo)炎癥及肺纖維化過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在啟動(dòng)和調(diào)控纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，TGF-β1是最重要的細(xì)胞因子，其中以TGF-β1所占比例最高、活性最強(qiáng)。TGF-β1通過胞內(nèi)信號分子蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，趨化并促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖及成熟分化，刺激成纖維細(xì)胞大量合成I、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白，尤其是Ⅳ型膠原蛋白，以增加肺間質(zhì)的膠原成分，同時(shí)TGF-β1可抑制膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成，增加蛋白酶抑制物的形成，以減少肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，是組織纖維化過程中始發(fā)的致纖維化因子。但TGF-β1的單獨(dú)作用并不能引起纖維化，事實(shí)上，TGF-β1促進(jìn)臟器纖維化的信號是通過CTGF向下轉(zhuǎn)導(dǎo)的〔8〕。CTGF是介導(dǎo)TGF-β1促纖維化作用的一個(gè)重要的下游因子，應(yīng)用反義CTGF技術(shù)或抗CTGF中和抗體可以阻斷TGF-β1引起的促纖維化效應(yīng)〔9〕。還有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的皮膚纖維化模型中，TGF-β1可以引起短期的纖維化組織增生，而同時(shí)注射CTGF則可以引起持續(xù)穩(wěn)固的纖維組織增生〔10〕。本實(shí)驗(yàn)肺組織免疫組化結(jié)果表明，灌注 BLM后各期大鼠肺組織TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)均顯著升高；給予NaHS治療后TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)在各期均顯著降低，相關(guān)性分析顯示，各組各期TGF-β1與CTGF呈顯著正相關(guān)，提示外源性H2S可以抑制TGF-β1信號通路，減少其下游調(diào)控因子CTGF蛋白表達(dá)，發(fā)揮其抗纖維化作用。

總之，本文表明外源性H2S可以通過抑制TGF-β1信號通路，下調(diào)CTGF蛋白表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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