張 明 溫都蘇 任 明 李然偉 劉祿成

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

膀胱尿路上皮癌男性明顯多于女性，且易復(fù)發(fā)。隨著對(duì)腫瘤分子生物學(xué)研究的深入和癌基因?qū)W說的確立，靶向基因制劑聯(lián)合化療預(yù)防腫瘤治療后復(fù)發(fā)的抗腫瘤治療策略成為目前腫瘤研究與治療的熱點(diǎn)之一。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，并被證實(shí)既能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)也與化療耐藥和患者不良預(yù)后有關(guān)〔1～3〕。本文針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)了反義HIF-1α聯(lián)合絲裂霉素C(MMC)治療裸鼠原位膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究，旨在為臨床膀胱癌的治療制定更加實(shí)用有效的新方案提供參考。

1 材料與方法

1.1主要材料來源 人膀胱癌T24細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。BALB/C裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。原位凋亡檢驗(yàn)法(TUNEL)試劑盒和噻唑藍(lán)(MTT)比色儀分別購(gòu)自北京中山生物公司和美國(guó)Sigma公司。MMC來自日本山丸株式會(huì)社制藥公司。ESDREF1.5T三維核磁掃描儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司。反義HIF-1α載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建〔4〕。

1.2實(shí)驗(yàn)方法步驟 ①按照參考文獻(xiàn)〔4〕所述方法步驟，構(gòu)建人膀胱癌細(xì)胞裸鼠原位膀胱移植瘤模型和療效評(píng)價(jià)及瘤體標(biāo)本處理。選取30只瘤體大小幾乎相同的成瘤裸鼠，隨機(jī)分為三組，10只/組，每隔7 d分別經(jīng)尿道膀胱灌注反義HIF-1α載體+MMC，反義HIF-1α載體，MMC，均灌注4次/組，28 d為1個(gè)療程。每隔9 d，即灌注后的第2天用ESDREF1.5T核磁掃描儀檢測(cè)腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第5天處死所有裸鼠，迅速切開膀胱，完整剝?nèi)×鲶w稱重，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，以長(zhǎng)(mm)×寬(mm)計(jì)算出腫瘤大小，然后按病理常規(guī)要求切片備檢。② MTT法檢測(cè)瘤細(xì)胞增殖。5 μm厚的組織切片依次脫蠟→脫水→雙氧水封閉→滴加MTT顯色液→磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌→抗地高辛抗體孵育→蘇木素復(fù)染。以PBS代替MTT顯色液作為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照切片經(jīng)DNA酶Ⅱ處理后按MTT法程序染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿呈棕黃色者為增殖細(xì)胞陽性。每張切片觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，胞漿呈棕黃色的細(xì)胞在切片視野中所占百分率的均值即為瘤細(xì)胞的增殖率。見圖1。③ TUNEL法檢測(cè)瘤細(xì)胞凋亡率。繼續(xù)用②中處理的標(biāo)本，不同的是，更換MTT顯色液為TUNEL反應(yīng)液，用PBS代替TUNEL作為陰性對(duì)照。陽性對(duì)照切片經(jīng)DNA酶Ⅰ處理后按TUNEL試劑盒所示染色步驟進(jìn)行。結(jié)果判定：胞核呈黃褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，其在每張切片，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中所占百分率的均值為瘤細(xì)胞凋亡率。見圖1。

圖1 T24細(xì)胞的增殖、凋亡情況(×400)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1聯(lián)合和單一用藥治療對(duì)成瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果 反義HIF-1α制劑+MMC用藥和反義HIF-1α載體及MMC單獨(dú)治療組瘤細(xì)胞的增殖率分別是：(19.8±3.7)%,(48.6±5.9)%,(35.8±7.4)%。各治療組腫瘤細(xì)胞雖均發(fā)生不同水平的增殖抑制現(xiàn)象，但以聯(lián)合用藥組增殖抑制最為明顯，與單獨(dú)用藥的兩組分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。TUNEL法檢測(cè)瘤細(xì)胞凋亡率的結(jié)果依次是聯(lián)合組(82.6±5.7)%,反義HIF-1α組(43.7±8.4)%,MMC組(57.9±4.8)%,聯(lián)合用藥組瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥組(P<0.05)。

2.2聯(lián)合和單一用藥治療對(duì)成瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 聯(lián)合治療組、反義HIF-1α和MMC治療組的腫瘤體積從第9、21、30天開始，均不同程度的逐漸變小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)得聯(lián)合組和單獨(dú)組的腫瘤大小依次是〔(15.28±6.37)mm2〕，〔(31.94±5.72)mm2〕，〔(27.85±3.81)mm2〕。單獨(dú)用藥兩組相對(duì)比，差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但聯(lián)合用藥組分別與單一用藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3聯(lián)合和單一用藥治療對(duì)成瘤裸鼠淋巴轉(zhuǎn)移的影響 單純基因制劑和單純化療治療的10只成瘤裸鼠中均出現(xiàn)4只膀胱外盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%，而基因治療+化療治療的10只成瘤裸鼠中僅1只轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為10%。組間比較差異顯著(P<0.01)。

3 討 論

研究表明，缺氧在實(shí)體腫瘤中普遍存在，缺氧微環(huán)境不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等調(diào)控，而且上調(diào)耐藥基因表達(dá)，選擇性抗凋亡〔5～7〕。HIF-1α為近年來發(fā)現(xiàn)的一種是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的主要調(diào)節(jié)因子，其過度表達(dá)時(shí)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，從而加速腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移〔8，9〕。鎖核酸(LNA)類寡核苷酸代表第三代反義技術(shù)，對(duì)靶向mRNA具有很高的特異親合性和強(qiáng)大的組織穩(wěn)定性，人們將其主要應(yīng)用于基因研究和抑制腫瘤基因表達(dá)方面〔10，11〕。本研究結(jié)果提示：① 膀胱癌T24細(xì)胞株中過表達(dá)的HIF-1α可以通過反義HIF-1α載體抑制。② 單一基因制劑或細(xì)胞毒抗癌藥物雖對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但不能達(dá)到理想的治療效果。③ 基因制劑與化療藥物聯(lián)合治療，明顯優(yōu)于單一用藥。

4 參考文獻(xiàn)

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