陳瑾歆 何 軍 張娟娟 蒲 宇 王含彥

(川北醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,四川 南充 637000)

肝癌發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，發(fā)展迅速，預(yù)后差，目前尚無的特效治療方法，常規(guī)化療效果不佳，且西醫(yī)化療不良反應(yīng)大，特別是老年患者難以承受，因此，副作用較小的黃芪多糖(APS)、斑蝥酸鈉(SCA)等輔助化療中藥廣泛應(yīng)用于臨床，并呈現(xiàn)較好的臨床效果。中藥抗腫瘤作用的分子機制研究目前較少，本研究通過觀察APS聯(lián)合SCA對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達的影響，探討APS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2(HepG2)，從中國科學(xué)院上海細(xì)胞所引進；斑蝥酸鈉維生素B6注射液(貴州柏強制藥有限公司)；APS注射液(天津賽諾制藥有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；一抗：Bcl-2、抗GAPDH抗體(proteintech,USA)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(Abcam,USA)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HepG2細(xì)胞以10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5%的CO2孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為正常對照組(n=5)、SCA處理組(2.5 mg/L，n=5)、APS處理組(200 mg/L，n=5)、APS聯(lián)合SCA處理組(APS200 mg/L+SCA2.5 mg/L，n=5)。以RPMI1640培養(yǎng)液配制SCA和/或APS注射液。取指數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗，血清饑餓法使細(xì)胞同步化后棄培養(yǎng)基，分別加入含有SCA和/或APS培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)24 h備用。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色 用4%多聚甲醛固定各組HepG2細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)SP法進行免疫組化染色，DAB顯色。以胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.4Western印跡 細(xì)胞處理24 h后分組收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心10 min取上清收集細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法分析定量調(diào)整蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。變性的蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗：Bcl-2(1∶800)、抗GAPDH抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶7 000)室溫孵育2 h，再行TBST洗膜，加入ECL發(fā)光，常規(guī)顯影并分析圖像，每個樣本重復(fù)3次。Bcl-2的表達水平以圖像Bcl-2與GAPDH的灰度比(Bcl-2/GAPDH)表示，比值越大，Bcl-2的表達水平越高。

2 結(jié) 果

2.1APS/SCA對HepG2細(xì)胞增殖的影響 見圖1，與對照組相比較，各實驗組在單位視野中的凋亡細(xì)胞均明顯增多，其中APS聯(lián)合SCA處理組的凋亡細(xì)胞最多，提示SCA和APS對體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞生長均有抑制作用，APS聯(lián)合SCA作用最明顯。

圖1 APS/SCA對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用(×400)

2.2不同濃度的APS/SCA對HepG2細(xì)胞中Bcl-2表達的影響 與對照組相比(0.157±0.011)，SCA處理組和APS處理組Bcl-2表達均受到顯著抑制(0.114±0.013、0.122±0.008，P<0.01)；與APS組比較，SCA對HepG2細(xì)胞中Bcl-2表達的抑制作用較強，但二者無明顯差異(P>0.05)；APS聯(lián)合SCA處理組Bcl-2表達受到明顯抑制(0.079±0.008)，與對照組、SCA處理組、APS處理組比較均有顯著差異(P<0.01)。實驗結(jié)果提示APS聯(lián)合SCA對HepG2細(xì)胞Bcl-2表達的抑制作用更為明顯。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是在生理或病理條件下由細(xì)胞內(nèi)基因及細(xì)胞外因子調(diào)控的細(xì)胞主動死亡生物學(xué)過程〔1〕。目前認(rèn)為惡性腫瘤發(fā)病的主要分子機制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限制增生和凋亡減少〔2〕，因此抑制腫瘤細(xì)胞惡性增生、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡目前成為研究腫瘤治療新途徑的熱點。細(xì)胞凋亡機制復(fù)雜，普遍認(rèn)為線粒體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，處于凋亡調(diào)控的中心位置，各種凋亡信號刺激細(xì)胞損傷引發(fā)線粒體內(nèi)凋亡分子Caspases的級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生凋亡〔3〕。Caspases凋亡分子的釋放受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2家族)是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因，調(diào)節(jié)上游凋亡信號進入線粒體引發(fā)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑〔4〕。Bcl-2家族中Bcl-2為抗凋亡蛋白，其表達減少會導(dǎo)致細(xì)胞主動進入凋亡程序〔5〕。

黃芪在抗腫瘤方面展示了較好的效果，APS是黃芪抗腫瘤的有效成分，可調(diào)理免疫功能、減輕放化療毒副反應(yīng)〔6〕。其抗腫瘤機制尚不明確，傳統(tǒng)研究認(rèn)為APS的抗腫瘤作用可能與增強機體免疫功能的作用有關(guān)〔6〕。近年的研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用可能還有其他機制如對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，有一定促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用等〔7〕，且APS和其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時具有協(xié)同抗腫瘤作用，可明顯提高腫瘤治療的療效。SCA是一種廣譜抗癌藥，對消化道惡性腫瘤有較好療效，有抗癌和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，目前認(rèn)為作用機制可能是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔8〕。本研究結(jié)果提示：APS和SCA處理HepG2細(xì)胞，均可引起細(xì)胞凋亡，APS聯(lián)合SCA處理的細(xì)胞凋亡最明顯，Western印跡法檢測各組凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達，APS、SCA處理組Bcl-2基因的表達均明顯抑制，但二者間無明顯差異，APS聯(lián)合SCA處理組Bcl-2表達受到的抑制作用最強，實驗結(jié)果提示APS可能通過對凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)促進細(xì)胞凋亡，與SCA聯(lián)合應(yīng)用會增強對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。綜上，APS可明顯抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達，聯(lián)合SCA對Bcl-2抑制作用更為明顯，其與BAX家族成員協(xié)同作用的分子機制還有待于進一步研究。

4 參考文獻

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