周翔宇 劉 寧 閆 珊 張志超 孫連坤

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，吉林 長春 130021)

目前卵巢癌是威脅女性健康的一個重要問題，化療成為主要的治療手段〔1〕。然而，化療藥物特異性差，其藥物的損害作用也會攻擊周圍的正常組織，健康器官進一步被損害，從而帶來更大的損傷。研究發(fā)現(xiàn)S1能誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞凋亡〔2，3〕，本實驗組之前的研究發(fā)現(xiàn)S1能有抑制卵巢癌細胞生存〔4〕，因此本實驗進一步探討S1誘導(dǎo)人卵巢癌細胞(SKOV3)細胞死亡機制，檢測S1對細胞線粒體凋亡途徑的影響，為S1進入臨床治療卵巢癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與細胞 S1 由大連理工大學(xué)精細化工國家重點實驗室設(shè)計并提供；十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基二乙胺(TEMED)、丙烯酰胺、N,N-二甲基雙丙烯酰胺、吐溫-20和疊氮鈉物購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基購美國HyClone公司；胰酶購自美國Thermo公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2、Bax、細胞色素(Cyto)C抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin購自EPITOMICS公司；二抗購自美國Pierce公司。SKOV3細胞系由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供。

1.2細胞培養(yǎng) SKOV3細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基常規(guī)方法培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期細胞分組進行實驗。

1.3JC-1檢測線粒體膜電勢 收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1～2次，加入500 μl JC-1染色液，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；3 000 r/min，4℃ 離心5 min，棄上清；加入1 ml預(yù)冷的JC-1緩沖液(1×)洗滌2次；加入200～300 μl JC-1緩沖液(1×)混勻；用流式細胞儀檢測分析。

1.4Western 印跡 離心收集細胞，PBS 洗滌2次；加入細胞裂解液并提取蛋白，測濃度后取60 μg蛋白進行SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳；采用BIO-RAD轉(zhuǎn)移裝置將蛋白移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入5% 的脫脂奶粉中1～2 h，封閉膜上的非特異結(jié)合位點；加入相應(yīng)的一抗，4℃冰箱中過夜。次日PBS洗膜3次；加入1∶1 000稀釋二抗室溫孵育1.5 h；PBS洗膜3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像后保存。

2 結(jié) 果

2.1JC-1染色檢測線粒體膜電勢 Bcl-2蛋白家族是S1誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡的關(guān)鍵分子，一旦表達失衡，會導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，線粒體膜電勢(ΔΨ)降低。根據(jù)文獻報道〔4〕，選取5、10 μmol/L S1作用SKOV3細胞8 h，JC-1染色，流式細胞儀檢測細胞熒光強度。S1作用SKOV3細胞熒光強度明顯降低，表明線粒體膜電勢(ΔΨ)明顯降低(P<0.05，n=3)。

2.2Western 印跡方法檢測S1對SKOV3細胞Cyto C蛋白表達的影響 當(dāng)細胞受到內(nèi)源性凋亡刺激時，線粒體膜孔道開放，電勢下降，致使線粒體內(nèi)Cyto C釋放入胞質(zhì)，胞質(zhì)中Cyto C的含量明顯增加。與對照組相比，S1作用SKOV3細胞8 h，胞漿Cyto C蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=3)。見圖1。

圖1 S1對人卵巢癌細胞胞漿Cyto C蛋白表達影響

2.3S1影響線粒體凋亡相關(guān)蛋白的活化 Bcl-2和Bax都是線粒體凋亡途徑的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)細胞受到內(nèi)源性凋亡刺激時，抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax活化，進而激活下游caspase。5、10 μmol/L S1作用SKOV3細胞8 h，Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達增加，Bax/ Bcl-2表達顯著升高(P<0.05，n=3)。見圖2。

圖2 S1對人卵巢癌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達影響

3 討 論

細胞死亡是生命組成最基本的部分，在同一個組織中，多種細胞死亡方式可能都會被誘導(dǎo)，但凋亡的誘導(dǎo)往往是最快的〔5〕。凋亡也被稱為程序性細胞死亡(PCD)，是通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑，外源性凋亡的發(fā)生主要是通過細胞表面死亡受體誘導(dǎo)，而內(nèi)源性凋亡主要通過打擊線粒體膜的穩(wěn)定性〔6，7〕。通過結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源性凋亡過程中，主要是Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白之間的蛋白相互作用，從而控制線粒體的完整性〔8，9〕。大量的研究表明線粒體與細胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位的破壞，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

細胞凋亡調(diào)控是多基因參與的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，Bcl-2蛋白是重要的凋亡抑制基因。有研究表明，在抗凋亡蛋白Bcl-2過表達的細胞內(nèi)，當(dāng)化療藥物作用的時候，會促使Apaf-1、Cyto C和caspase形成聚集體(Apoptosome)，這個聚集體會阻止Cyto C的釋放，以及抑制caspase的活化和級聯(lián)反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2在腫瘤中的高表達可以使腫瘤細胞耐藥性增高。因此，特異性的靶向作用Bcl-2抗凋亡蛋白，已經(jīng)成為治療腫瘤的新方法〔10〕。目前對于Bcl-2蛋白家族抑制劑的研究越來越多，并且合成了很多作用靶點不同的Bcl-2抑制劑，包括HA14-1、GX15-070、BI-33、ABT 737等。實際上，應(yīng)用我國自行研制小分子BH3-only蛋白模擬物S1，與抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1蛋白均具有高度的親和性，是Bcl-2和Mcl-1的雙重抑制劑〔2～4〕。本研究結(jié)果提示S1通過破壞線粒體膜電勢，迫使線粒體內(nèi)大量Cyto C釋放入胞漿誘導(dǎo)SKOV3細胞發(fā)生凋亡。既往的研究表明，在正常狀態(tài)下，Bcl-2通過與Bax結(jié)合抑制Bax蛋白活性，進而抑制細胞凋亡。當(dāng)BH3-only蛋白通過其BH3區(qū)域與Bcl-2結(jié)合，釋放的Bax在線粒體外膜形成寡聚體孔道，因而可以破壞線粒體膜電勢〔8，9〕。本研究結(jié)果提示S1可能是通過抑制Bcl-2蛋白，使得Bax蛋白活性增加，從而介導(dǎo)線粒體膜電勢的改變，釋放Cyto C，觸發(fā)線粒體途徑凋亡。

目前對于S1治療卵巢癌的研究僅限于體外實驗研究，還需進一步進行體內(nèi)實驗研究，為靶向Bcl-2抗腫瘤藥物S1治療卵巢癌提供了實驗與理論依據(jù)。

4 參考文獻

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