楊 彬 余麗娟 王 佳 趙 磊 胡馨月 紀(jì)超男 魏玉玲 陽(yáng)群芳 蔣青松 楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

缺血性腦損傷可分為局部腦缺血與全腦缺血損傷。局部腦缺血模型，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可模擬臨床上的中風(fēng)。而全腦缺血模型除了模擬中風(fēng)外，更側(cè)重于模擬臨床上的窒息、休克、心臟驟停、嚴(yán)重心律失常以及低氧血癥的腦損傷〔1〕。局部腦缺血的主要模型為大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，而全腦缺血損傷的模型主要有四動(dòng)脈結(jié)扎模型，雙動(dòng)脈結(jié)扎合并低血壓模型，窒息性心臟驟停模型〔2〕。目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用Pulsinelli 四血管阻斷法制作動(dòng)物全腦缺血再灌注模型〔3〕，但是其造模過(guò)程復(fù)雜。由于大鼠腦血管的解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，因而認(rèn)為大鼠是建立腦缺血損傷模型最適宜的動(dòng)物。激光多普勒血流(LDF)測(cè)定法是一種準(zhǔn)確反映微循環(huán)灌注的測(cè)量手段〔4〕，Schmid-Elsaesser等〔5〕發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦血流監(jiān)測(cè)可以用來(lái)證明MCAO模型制作是否成功，但LDF在全腦缺血再灌注(I/R)損傷模型中的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外常用的二血管阻斷加低血壓法〔6，7〕，并使用LDF對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，建立一種手術(shù)操作簡(jiǎn)單、死亡率低、重復(fù)性好的大鼠全腦缺血再灌注模型，為進(jìn)一步深入探討腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制、病理特點(diǎn)及其防治打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠33只，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書(shū)編號(hào)SCXK(渝)2007-0001。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，溫度25 ℃±1 ℃,相對(duì)濕度50%±2%。12 h光照晝夜節(jié)律，自由飲水，手術(shù)前12 h禁食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分假手術(shù)組(n=7)；LDF監(jiān)測(cè)I/R組(LDF+I/R組，n=13)，無(wú)LDF監(jiān)測(cè)I/R組(I/R組，n=13)。每組大鼠取3只用于組織病理學(xué)檢測(cè)，其余大鼠用于SOD活性,MDA含量測(cè)定。所有與動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作，均在重慶醫(yī)科大學(xué)道德與倫理委員的許可和指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2主要儀器與試劑 多普勒激光血流儀(Moor 公司；VMS-LDF1型；英國(guó))；Morris 水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；熒光正置顯微鏡(Olympus;日本)；丙二醛試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成試劑有限公司)

1.3模型制作 參照Gr?gaard〔6〕，羅維楠〔7〕等的方法并稍作改進(jìn)，大鼠用4%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，使大鼠處于仰臥位并固定于鼠解剖板，頸正中剃毛，縱向剪開(kāi)頸部皮膚約2 cm，鈍性分離組織和肌肉，暴露并小心分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈與一側(cè)頸總靜脈，下穿約5 cm絲線備用。結(jié)扎頸總靜脈遠(yuǎn)心端，在近心端剪一切口。將連接于注射器針頭上的聚乙烯導(dǎo)管(預(yù)先肝素內(nèi)浸泡)沿頸總靜脈切口處向心臟方向插入，插管后輸入2 ml肝素生理鹽水(250 U/100 ml)。緩慢抽取大鼠總血量約30%的血液。提起頸總動(dòng)脈下預(yù)先備置的絲線，無(wú)創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，計(jì)時(shí)松開(kāi)動(dòng)脈夾，緩慢回輸血液，拔出導(dǎo)管，結(jié)扎頸總靜脈近心端，縫合傷口，強(qiáng)力碘消毒。假手術(shù)組大鼠不阻斷血流，不抽血，其余過(guò)程與手術(shù)組大鼠相同。手術(shù)過(guò)程中大鼠肛溫保持在36.5 ℃～37.2 ℃。

1.4腦血流測(cè)定 用LDF監(jiān)測(cè)大鼠整個(gè)手術(shù)過(guò)程中的腦血流(CBF)變化,大鼠腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，俯臥，頭部剃毛，剪開(kāi)頭部皮膚約2 cm，用浸滿過(guò)氧化氫的棉簽拭去滲出液，暴露出顱骨，將多普勒血流儀的探頭用膠水固定于顱骨上，并使大鼠處于仰臥位，進(jìn)行I/R手術(shù)，LDF記錄大鼠手術(shù)過(guò)程中的CBF變化。

1.5水迷宮 考慮到動(dòng)物手術(shù)后傷口愈合，在術(shù)后8～12 d進(jìn)行水迷宮測(cè)定大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。整個(gè)測(cè)試過(guò)程分為二個(gè)階段：第一階段(定向航行)，每天晚上8點(diǎn)至10點(diǎn)訓(xùn)練，訓(xùn)練4 d，第一天訓(xùn)練時(shí)將大鼠放到隱蔽于水中的平臺(tái)上讓其適應(yīng)10 s，然后讓其自由游泳找到平臺(tái)，180 s內(nèi)未找到平臺(tái)者，實(shí)驗(yàn)者協(xié)助將其引至平臺(tái)。從第二天起，每天訓(xùn)練4次，將大鼠分別從A、B、C、D 4個(gè)位置，面向池壁放入水中，讓大鼠定向航行；第二階段(空間檢測(cè))，在第5天時(shí)進(jìn)行測(cè)試，并將大鼠從前一天最后一次訓(xùn)練時(shí)的位置放入水中，記錄大鼠第一次登上平臺(tái)的時(shí)間，即尋臺(tái)潛伏期(超過(guò)180 s記為180 s)，水迷宮上方安置攝像機(jī)，同步記錄大鼠尋臺(tái)運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.6組織病理學(xué)檢查 三組大鼠水迷宮測(cè)試完成后，各取3只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛在體腦組織固定。HE染色觀察皮層與海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，于連續(xù)3個(gè)高倍鏡視野下，計(jì)數(shù)核固縮、核壞死神經(jīng)元數(shù)目占總神經(jīng)元數(shù)目的百分率，作為神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)改變的相對(duì)量〔7〕。

1.7SOD和MDA含量測(cè)定 水迷宮完成后，將剩下的大鼠斷頸法處死，冰面分離皮層海馬組織，液氮速凍，然后保存于-80℃低溫冰箱，用時(shí)將組織取出，用生理鹽水制成10 g/L的勻漿液。以黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，TBA法檢測(cè)MDA含量，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物存活率 假手術(shù)組及有LDF監(jiān)測(cè)組大鼠術(shù)后全部存活，無(wú)死亡；無(wú)LDF監(jiān)測(cè)組1只大鼠手術(shù)過(guò)程中死亡，2只大鼠術(shù)后24 h死亡，存活率76.92%，明顯低于其他兩組(P<0.01)。

2.2LDF監(jiān)測(cè)大鼠I/R模型的腦血流變化 假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基線血流為(184.25±10.80)PU，手術(shù)過(guò)程中大鼠采用腹式呼吸，呼吸的深淺、手術(shù)時(shí)觸碰到血管等因素都會(huì)影響血流波動(dòng)。在分離頸總動(dòng)脈時(shí)，牽扯到迷走神經(jīng)，影響到動(dòng)物的呼吸，可造成腦血流值小幅降低。分離完成后，動(dòng)物呼吸恢復(fù)正常，血流值也恢復(fù)正常。

圖1 I/R過(guò)程中腦血流動(dòng)態(tài)變化

全腦缺血成功大鼠缺血前，基線腦血流平均值(167.49±10.69)PU,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，血流值迅速降低，在缺血20 min過(guò)程中腦血流平均值為(40.71±6.10)PU，血流降幅75%；夾閉完成，取下動(dòng)脈夾后，血流迅速回升，在觀察期內(nèi)腦血流平均值為(116.00±6.55)PU，再灌注時(shí)，血流恢復(fù)至缺血前基線血流的70.46%。見(jiàn)圖1。

圖2 三組大鼠在第5天的尋臺(tái)路徑

2.3I/R對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 三組大鼠尋臺(tái)潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸減少。與假手術(shù)組比較，兩組I/R組大鼠尋臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)，尋臺(tái)路徑也明顯增加；有、無(wú)LDF監(jiān)測(cè)兩組大鼠尋臺(tái)潛伏期、尋臺(tái)路徑無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖2，表1所示。

2.4I/R損傷對(duì)大鼠腦組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常,輪廓清晰。I/R組大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞排列較紊亂，胞核固縮深染，呈致密濃染塊狀或顆粒狀，有的細(xì)胞界限不清,結(jié)構(gòu)消失；而有、無(wú)LDF監(jiān)測(cè)兩組大鼠之間神經(jīng)元損傷無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖3，圖4，表2。

2.5I/R損傷對(duì)大鼠皮層海馬組織SOD活性和MDA含量變化的影響 與假手術(shù)組比較，另兩組I/R組大鼠皮層海馬SOD活性顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，而有無(wú)LDF監(jiān)測(cè)組大鼠之間SOD活性、MDA含量無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。

表1 I/R對(duì)大鼠尋臺(tái)潛伏期及第5天尋臺(tái)路徑的影響

表2 各組大鼠皮層海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)

表3 I/R對(duì)大鼠皮層海馬組織SOD活性、MDA含量變化的影響

圖3 大鼠皮層組織病理學(xué)(HE，×400)

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)(HE，×400)

3 討 論

全腦缺血再灌注的原理為夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈時(shí)，兩側(cè)頸總動(dòng)脈的血液供應(yīng)停止,而兩側(cè)椎動(dòng)脈的血流仍可通過(guò)基底動(dòng)脈流至大腦動(dòng)脈環(huán)，從頸靜脈抽取一定量血液可以有效降低缺血期后交通動(dòng)脈血流量,從而減少后交通動(dòng)脈的代償作用,使腦缺血更為明顯。缺血完成后解除兩側(cè)頸總動(dòng)脈的阻斷,并回輸從頸總靜脈抽出的血液，使大腦的血流恢復(fù),實(shí)現(xiàn)再灌注。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于通過(guò)LDF監(jiān)控手術(shù)過(guò)程中CBF的變化以降低動(dòng)物死亡率，同時(shí)增加造模成功率。LDF測(cè)定法是一種準(zhǔn)確反映微循環(huán)灌注的測(cè)量手段〔4〕。劉宇等〔8〕用LDF判斷活體大鼠MCAO模型制作成功與否，發(fā)現(xiàn)LDF的檢測(cè)結(jié)果與TTC染色證實(shí)腦梗死病灶具有很好的一致性，符合率達(dá)到88%，Harada等〔9〕用LDF評(píng)價(jià)MCAO模型，發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦血流監(jiān)測(cè)可以減少腦梗死體積的變異系數(shù)，減少制作過(guò)程中動(dòng)物死亡率。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對(duì)前期建立的I/R模型進(jìn)行進(jìn)一步的改良與優(yōu)化。

研究認(rèn)為腦血流減少至45%就能夠影響大腦的能量代謝〔10〕。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)大鼠體重抽取約總血量30%的血液并夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)I/R損傷，但由于個(gè)體差異的存在，抽取30%血量并夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，部分大鼠CBF降低卻少于55%，對(duì)這部分大鼠來(lái)說(shuō)此操作可能只是使其“血量減少”，而不能稱為缺血，若將這部分大鼠直接納入實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，必然會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，通過(guò)LDF的監(jiān)測(cè)，對(duì)這部分大鼠應(yīng)多抽取血量并使其CBF降低至45%以下，以實(shí)現(xiàn)缺血的效果；而部分大鼠夾閉后CBF已經(jīng)降低至缺血的閾值，但出現(xiàn)心跳急劇增加，呼吸困難等癥狀，其缺血太多，應(yīng)部分回輸血液再夾閉其雙側(cè)頸總動(dòng)脈并控制其CBF降低的幅度在55%以上。

水迷宮檢測(cè)表明I/R對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生明顯損傷。HE結(jié)果說(shuō)明I/R對(duì)大鼠神經(jīng)元產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。氧化應(yīng)激在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要作用〔11〕。本文說(shuō)明I/R導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，I/R大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙顯著，神經(jīng)元損傷，氧化應(yīng)激損傷明顯，此模型可用于腦缺血再灌病理生理和形態(tài)學(xué)等變化及某些藥物和治療手段的基礎(chǔ)研究。

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