王靜波

(解放軍第309醫(yī)院眼科，北京 100091)

肝細(xì)胞生長因子(HGF)是目前已知的生物活性最廣泛的生長因子之一。HGF通過與特異性膜受體c-met結(jié)合而發(fā)揮其多樣生物學(xué)作用。除了促進(jìn)有絲分裂活性外，HGF還作為離散因子促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散和遷移。研究證實(shí)，HGF/c-met在組織器官損傷后的再生中發(fā)揮重要作用。本研究觀察糖尿病大鼠肝臟中HGF的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，兔抗鼠HGF多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，枸櫞酸鹽粉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑、二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒、蘇木素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)，安穩(wěn)血糖儀及血糖測試條(長沙三諾有限公司)，冷凍包埋劑(櫻花，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 雄性SD大鼠24只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(120±20 g)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。大鼠在SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度25℃左右，濕度約50%。明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，進(jìn)行動(dòng)物造模。

造模前，禁食12 h(不禁水)。STZ 65 mg/kg腹腔注射，對照組腹腔注射枸櫞酸鹽溶液。72 h后測血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。每周監(jiān)測血糖。

1.3標(biāo)本制備 造模成功后第3、6、9、12和15周，分別采用過量氯胺酮麻醉致死，迅速摘除肝臟。切取塊狀肝臟大葉組織，冷凍包埋劑包埋，連續(xù)切出5 μm厚度切片，貼于免疫組化專用防脫載玻片上，晾干后甲醇固定，-80℃冰箱保存。

1.4免疫組化染色及結(jié)果判讀 冰凍切片用PBS沖洗，3%過氧化氫溶液室溫10 min，PBS洗，稀釋的HGF抗體(1∶200)室溫孵育2 h，通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體37℃ 20 min，PBS洗，DAB顯色，PBS洗，蘇木素復(fù)染，自然水沖洗，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹膠封片，照相。所有切片由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師盲法閱片做出判定，每張切片觀察5個(gè)×400視野。以組織切片背景清晰、細(xì)胞漿染為淡黃至棕黃色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：不著色者為陰性，淡黃色及著色細(xì)胞<1/3為弱陽性，黃色及著色細(xì)胞占1/3～1/2為中度陽性，棕褐色著色陽性細(xì)胞>1/2為強(qiáng)陽性。

2 結(jié) 果

2.1糖尿病大鼠一般情況觀察 對照組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏。糖尿病大鼠出現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀，多飲、多食、多尿，明顯消瘦，精神逐漸萎靡，早期多動(dòng)，后期反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作緩慢，毛豎而無光澤。12 w時(shí)，部分大鼠出現(xiàn)白內(nèi)障。

2.2肝臟一般結(jié)構(gòu)觀察 對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊。糖尿病組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見大量小空泡。糖尿病12 w時(shí)，肝細(xì)胞開始水腫；糖尿病15 w時(shí)，肝細(xì)胞水腫尤明顯。

2.3肝細(xì)胞HGF的表達(dá) 對照組大鼠肝細(xì)胞HGF呈弱陽性表達(dá)。糖尿病3 w時(shí)，肝細(xì)胞HGF表達(dá)即開始增強(qiáng)。糖尿病6 w時(shí)，肝細(xì)胞HGF呈中度陽性表達(dá)。糖尿病12 w時(shí)，肝細(xì)胞HGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)。糖尿病15 w時(shí)，肝細(xì)胞HGF的表達(dá)較12 w時(shí)減弱，但較對照組仍明顯增強(qiáng)。見圖1。

圖1 大鼠肝臟肝細(xì)胞生長因子的表達(dá) (免疫組化，×200)

3 討 論

在美國，肝臟病變是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。2型糖尿病患者肝臟病變的標(biāo)準(zhǔn)死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心血管并發(fā)癥的標(biāo)準(zhǔn)死亡率。糖尿病肝臟病變包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌、慢性肝炎、急性肝功能衰竭，其中最常見的是非酒精性脂肪肝病。非酒精性脂肪肝病在2型糖尿病患者中發(fā)病率達(dá)50%，在糖尿病伴肥胖患者中發(fā)病率近100%〔1，2〕。

HGF是一種分泌型肝素親和糖蛋白，由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，與受體c-met結(jié)合并激活該受體的酪氨酸酶活性，促進(jìn)肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長、遷移、形態(tài)變化〔3〕。HGF對肝細(xì)胞有直接保護(hù)作用，可改善肝纖維化、降低死亡率〔4〕。在高表達(dá)HGF的轉(zhuǎn)基因小鼠，半乳糖胺對肝細(xì)胞的損傷幾乎被完全抑制。在肝臟部分切除后，肝細(xì)胞HGF的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖，促進(jìn)損傷的修復(fù)〔5〕。因而，HGF是肝細(xì)胞的保護(hù)劑。除了保護(hù)肝細(xì)胞外，HGF可保護(hù)機(jī)體的很多細(xì)胞，如腎小球細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞〔6，7〕。高糖刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及腎小球細(xì)胞，HGF的表達(dá)均表現(xiàn)為先增高后減低的趨勢〔6〕。與對照組相比，胰島過度表達(dá)HGF的轉(zhuǎn)基因小鼠，胰島體積增大，胰島數(shù)量增多，β細(xì)胞復(fù)制率提高〔7，8〕。HGF干預(yù)能使糖尿病大鼠β細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低〔8〕。

在糖尿病早期，高糖損傷引起機(jī)體防御反應(yīng)，肝細(xì)胞HGF表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，對損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)；隨著高糖刺激時(shí)間的延長，機(jī)體防御反應(yīng)的能力逐漸下降，高糖誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，HGF表達(dá)下調(diào)。Araújo等〔9〕的研究表明，HGF/c-met可能在肝臟胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。

在本研究中，筆者觀察到糖尿病肝臟中HGF蛋白呈先增高后減低的趨勢改變。但HGF的這種變化對肝細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制尚需更進(jìn)一步的研究。

4 參考文獻(xiàn)

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