吳 曉 游顏杰 黃繼紅 陳炯玉 洪超群 陳 蕾

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041)

卵巢癌5年生存率為30%～50%〔1〕。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)下調(diào)或缺失可使細(xì)胞呈現(xiàn)惡性形態(tài)并具備侵襲性生長特性。研究證實(shí)啟動子甲基化是導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)失活的重要方式之一〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)通過甲基化特異性PCR與免疫組化方法檢測了E-cadherin在卵巢癌中的基因甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理因素分析二者相關(guān)性，同時觀察去甲基化藥物處理細(xì)胞對E-cadherin表達(dá)及腫瘤惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院在2004～2010年收治的卵巢癌患者手術(shù)標(biāo)本50例。FIGO分期包括Ⅰ期9例，Ⅱ期3例，Ⅲ期32例，Ⅳ期6例；按腫瘤病理組織學(xué)分型，包括漿液性腺癌35例、黏液性腺癌9例、子宮內(nèi)膜樣腺癌6例；按Silverberg分級，包括G1期10例，G2期22例，G3期18例。患者年齡22～71(平均年齡51.12)歲。另外收集正常卵巢組織10例(年齡≤40歲，因其他疾病而切除卵巢者)。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及ES2由第四軍醫(yī)大學(xué)白求恩軍醫(yī)學(xué)院冉永剛碩士惠贈。

1.2試劑 5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)與四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma公司；GTpureTM石蠟組織DNA提取試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰荆珼NA提取試劑盒購自北京天根公司，EpiTect Kit與Hot Star Taq熱啟動酶購自德國Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；Trizol試劑與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、雌激素受體(ER)抗體、孕激素受體(PR)抗體，Ki-67抗體、二步法免疫組化檢測試劑與HRP標(biāo)記鼠抗人IgG購自北京中杉金橋公司；Matrigel購自美國BD Biosciences公司；Transwell培養(yǎng)小室購自美國Millipore公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 SKOV3與ES2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。去甲基化藥物處理后用含20 μmol/L 5-Aza-dC培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，72 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3卵巢癌組織與細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)檢測

1.3.1免疫組織化學(xué)染色 組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛緩沖固定液，石蠟包埋，4 μm厚切片，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)，EnVision二步法染色，常規(guī)DAB顯色，蘇木素對比染色，透明封片， PBS代替一抗作為空白對照。其中，E-cadherin鼠抗人單克隆抗體工作濃度為1∶250，ER為1∶100，PR為1∶100，Ki-67為1∶200。E-cadherin以細(xì)胞膜表達(dá)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞信號，≥75%即正常表達(dá)，<75%為表達(dá)下調(diào)〔4〕。ER和PR以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色陽性顆粒為陽性細(xì)胞信號，即陽性。Ki-67以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色陽性顆粒為陽性細(xì)胞信號，以百分比標(biāo)示取中位數(shù)，大于中位數(shù)的為陽性表達(dá)。

1.3.2RT-PCR檢測E-cadherin基因mRNA表達(dá)水平 以Trizol試劑與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取總RNA并合成cDNA，操作均按試劑說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物序列如下：E-cadherin基因上游引物：5′-TTAAGGGGTCTGTCATGGAAGGT-3′，下游引物：5′-GTGTAAGCGATGGCGGCATTGTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度109 bp；內(nèi)參照β-actin基因上游引物：5′-GAACCCCAAGGCCAACCGCGAGA-3′，下游引物：5′-TGACCCCGTCACCGGAGTCCATC-3′，產(chǎn)物長度149 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取適量產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。分別以β-actin與正常卵巢組織為內(nèi)參照與正常對照。

1.3.3Western印跡法檢測E-cadherin基因蛋白表達(dá)水平 取50 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含有5% BSA的TBST中4℃封閉過夜；加入1∶500稀釋的E-cadherin抗體于37℃作用1 h；充分洗滌后加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃作用30 min，以ECL Kit進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，膠片隨后進(jìn)行顯影、定影。分別以β-actin與正常組織為內(nèi)參照與正常對照。

1.4甲基化特異性PCR(MS-PCR)分析E-cadherin啟動子甲基化狀態(tài) 石蠟組織標(biāo)本與細(xì)胞基因組DNA提取分別使用GTpureTM石蠟組織DNA提取試劑盒和天根基因組DNA提取試劑盒，以EpiTect Kit進(jìn)行上述樣本亞硫酸氫鹽修飾與純化，各項(xiàng)操作按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)引物序列如下：E-cadherin基因甲基化(M)上游引物：5′-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGC-3′，下游引物：5′-CTCACAAATACTTTACAATTCCGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度213 bp；非甲基化(U)上游引物：5′-ATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGTGT-3′，下游引物：5′-CAAACTCACAAATACTTTACAATTCCA-3′，產(chǎn)物長度215 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)。甲基化狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)如下，僅非甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段為甲基化陰性；僅有甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段即為完全甲基化，甲基化引物與非甲基化引物均擴(kuò)增出相應(yīng)片段為不完全甲基化，完全甲基化和不完全甲基化均計(jì)為甲基化檢測陽性。

1.5MTT比色法檢測5-Aza-dC處理對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響 5×103/孔細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換含有20 μmol/L 5-Aza-dC的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，加入20 μl MTT(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液加入150 μl DMSO，緩慢振蕩10 min，測定各孔490 nm吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6侵襲實(shí)驗(yàn)檢測5-Aza-dC處理對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響 SKOV3細(xì)胞經(jīng)20 μmol/L 5-Aza-dC作用72 h后，2×105加入于預(yù)先鋪有Matrigel的Transwell上室，放入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出上室以甲醇固定后結(jié)晶紫染色，擦掉位于上室面未穿過膜的細(xì)胞后封片，計(jì)數(shù)5個200倍視野的遷移細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，小樣本資料選用Fisher精確檢驗(yàn)法，指標(biāo)間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析法。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子甲基化狀態(tài) E-cadherin甲基化在卵巢癌中檢測陽性率為64.0%(32/50)(圖1)。10例正常對照卵巢組織中未檢測到出現(xiàn)E-cadherin甲基化。結(jié)合臨床病例資料分析，E-cadherin甲基化與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)及ER、PR與Ki67表達(dá)水平均無顯著相關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.2卵巢癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平 卵巢癌組織中E-cadherin表達(dá)于癌細(xì)胞胞膜，其表達(dá)下調(diào)率為60.0%(30/50)(圖2)。在Ⅲ～Ⅳ期的晚期病例標(biāo)本中的E-cadherin表達(dá)率低于Ⅰ～Ⅱ期的早期病例標(biāo)本(P<0.05)；按不同病理類型分析，E-cadherin表達(dá)在漿液性腺癌組中顯著低于非漿液性腺癌組(黏液性腺癌組和子宮內(nèi)膜樣腺癌組)(P<0.01)。50例卵巢癌標(biāo)本中，E-cadherin表達(dá)同ER、Ki-67陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.327，P<0.05；rs=-0.298，P<0.005)，但與PR表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

2.3卵巢癌中E-cadherin甲基化與蛋白表達(dá)的相關(guān)性 32例E-cadherin甲基化陽性的卵巢癌樣本中27例(84.4%)E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而在甲基化檢測陰性的18例中E-cadherin表達(dá)下調(diào)者僅為6例(33.3%)(P<0.01)(表1)。采用Spearman等級相關(guān)分析表明，E-cadherin基因啟動子甲基化水平與其蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.408，P=0.004)。

表1 E-cadherin甲基化及E-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 卵巢癌組織中E-cadherin啟動子甲基化狀態(tài)(n=10)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測卵巢癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)(Envision法，×400)

A：RT-PCR；B：Western印跡

圖4 卵巢癌細(xì)胞中E-cadherin啟動子甲基化狀態(tài)

A：RT-PCR；B：Western印跡

2.4去甲基化試劑處理對卵巢癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平的影響 RT-PCR及Western印跡法結(jié)果顯示，SKOV3與ES2細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平同正常卵巢組織相比均出現(xiàn)明顯降低(圖3)。MS-PCR表明E-cadherin基因啟動子區(qū)域在兩種細(xì)胞中均處于不完全甲基化狀態(tài)。經(jīng)20 μmol/L 5-Aza-dC作用72 h后，SKOV3細(xì)胞中E-cadherin基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)。

2.5去甲基化藥物處理對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響 MTT檢測結(jié)果表明，經(jīng)20 μmol/L 5-Aza-dC作用后，SKOV3細(xì)胞(0.281±0.034)與ES2細(xì)胞(0.254±0.037)的增殖能力顯著降低，與未處理組相比分別降低28.0%(0.390±0.041)和32.3%(0.375±0.041,P<0.05)。

2.65-Aza-dC處理對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響 SKOV3與ES2細(xì)胞經(jīng)5-Aza-dC藥物處理后，通過濾膜遷移進(jìn)至侵襲小室下腔的數(shù)量分別為(237.9±33.5)和(265.7±32.1)，與未處理組相比分別減少38.2%(385.0±37.5)和27.4%(365.0±28.5,P<0.05)。

3 討 論

E-cadherin參與機(jī)體內(nèi)許多生物過程，包括調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性及形態(tài)的形成、細(xì)胞的聚集和遷移、細(xì)胞的識別和信號的傳導(dǎo)機(jī)制等等。通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，60.0%的卵巢癌中出現(xiàn)E-cadherin表達(dá)下調(diào)，與臨床分期和病理分級顯著相關(guān)，E-caderin表達(dá)下調(diào)參與卵巢腫瘤的發(fā)展過程。

E-cadherin啟動子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)可以導(dǎo)致其基因轉(zhuǎn)錄失活與蛋白表達(dá)缺失，與多種腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔5〕。本研究對50例標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因啟動子區(qū)域甲基化在卵巢癌中高頻發(fā)生(64.0%)，此結(jié)果與在其他惡性腫瘤中的相關(guān)研究報(bào)道基本一致〔2～4，6～9〕。

本研究結(jié)果還顯示E-cadherin甲基化與其蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明由啟動子甲基化導(dǎo)致基因失活可能是卵巢癌中E-cadherin表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制之一。然而，在發(fā)生甲基化的腫瘤組織其蛋白表達(dá)仍可呈陽性。腫瘤組織中混雜有正常組織是其原因之一，基因異質(zhì)性甲基化或一個等位基因發(fā)生甲基化也是一個重要的原因。而且在研究中也發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)呈陽性而同時發(fā)生甲基化的組織，其甲基化均表現(xiàn)為不完全甲基化的情況。此外，目前認(rèn)為DNA 甲基化主要在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的表達(dá)，有研究表明CpG島甲基化的密度與轉(zhuǎn)錄的抑制程度有關(guān)，弱的啟動子能被密度較低的甲基化完全抑制，而當(dāng)啟動子由增強(qiáng)子增強(qiáng)時，即可恢復(fù)轉(zhuǎn)錄功能〔10，11〕。部分腫瘤組織可能由于E-cadherin基因啟動子甲基化程度不足以抑制轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致了發(fā)生甲基化的組織其蛋白表達(dá)仍可為陽性。

促使腫瘤形成的遺傳因素包含兩大類機(jī)制，一是通過DNA核苷酸序列改變而形成突變，即遺傳學(xué)機(jī)制，另外就是表觀遺傳學(xué)機(jī)制，即DNA核苷酸序列不變，通過堿基修飾的改變導(dǎo)致基因表達(dá)水平的變化。上述兩種機(jī)制相互交叉存在。不同于遺傳學(xué)機(jī)制，表觀遺傳改變是可以逆轉(zhuǎn)的。逆轉(zhuǎn)抑癌基因的甲基化狀態(tài)可用于腫瘤的治療〔12〕。因此，本研究進(jìn)一步應(yīng)用去甲基化試劑處理卵巢癌細(xì)胞，觀察逆轉(zhuǎn)基因甲基化狀態(tài)是否可以恢復(fù)E-cadherin表達(dá)，希望在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)啟動子異常甲基化可以造成卵巢癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)沉默。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC處理兩株卵巢癌細(xì)胞株能有效誘導(dǎo)E-cadherin基因的RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果亦顯示，5-Aza-dC處理同時減弱腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力，該作用可能是通過抑制基因啟動子甲基化恢復(fù)E-cadherin正常表達(dá)等途徑實(shí)現(xiàn)的。

本研究表明E-cadherin在卵巢癌中的表達(dá)減弱與基因啟動子甲基化密切相關(guān)，應(yīng)用去甲基化藥物能夠恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)水平并抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征，有助于從基因水平上了解卵巢癌的發(fā)展規(guī)律。

4 參考文獻(xiàn)

1Ceccarelli F，Barberi S，Pontesilli A,etal.Ovarian carcinoma presenting with axillary lymph node metastasis：a case report〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2011;32(2):237-9.

2Espada J，Peinado H，Lopez-Serra L,etal.Regulation of SNAIL1 and E-cadherin function by DNMT1 in a DNA methylation-independent context〔J〕.Nucleic Acids Res，2011;39(21):9194-205.

3Niemhom S，Kitazawa S，Kitazawa R,etal.Hypermethylation of epithelial-cadherin gene promoter is associated with Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer Detect Prev，2008；32:127-34.

4Guo W，Dong Z，Guo Y,etal.Detection of promoter hypermethylation of the CpG island of E-cadherin in gastric cardiac adenocarcinoma〔J〕.Eur J Med Res，2009；14:453-8.

5Yi Kim D，Kyoon Joo J，Kyu Park Y,etal.E-cadherin expression in early gastric carcinoma and correlation with lymph node metastasis〔J〕.J Surg Oncol，2007;96(5):429-35.

6Tr?nkenschuh W，Puls F，Christgen M,etal.Frequent and distinct aberrations of DNA methylation patterns in fibrolamellar carcinoma of the liver〔J〕.PLoS One，2010;5(10):e13688.

7Yi TZ，Guo J，Zhou L,etal.Prognostic value of E-cadherin expression and CDH1 promoter methylation in patients with endometrial carcinoma〔J〕.Cancer Invest，2011;29(1):86-92.

8Bol GM，Suijkerbuijk KP，Bart J,etal.Methylation profiles of hereditary and sporadic ovarian cancer〔J〕.Histopathology，2010;57(3):363-70.

9Sun D，Zhang Z，Van do N,etal.Aberrant methylation of CDH13 gene in nasopharyngeal carcinoma could serve as a potential diagnostic biomarker〔J〕.Oral Oncol，2007;43(1):82-7.

10Tsai HC，Baylin SB.Cancer epigenetics：linking basic biology to clinical medicine〔J〕.Cell Res，2011;21(3):502-17.

11Rodríguez-Paredes M，Esteller M.Cancer epigenetics reaches mainstream oncology〔J〕.Nat Med，2011;17(3):330-9.

12Desmond JC，Raynaud S，Tung E,etal.Discovery of epigenetically silenced genes in acute myeloid leukemias〔J〕.Leukemia，2007；21:1026-34.