殷國田 趙林靜 黃艷梅 郭利偉 張新寧 李征輝 李 娜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性蛋白酶家族，能降解細胞外基質(zhì)蛋白，參與結(jié)締組織破壞與重構(gòu)。許多研究證實無論心力衰竭動物或人類，MMP基因表達和酶活性都是增高的，并且是心室重構(gòu)和擴張的重要觸發(fā)因素，而并非繼發(fā)于心力衰竭〔1～3〕。MMP-2的表達及活性過度增強時，可能參與心臟組織及脈管系統(tǒng)的重構(gòu)，從而引起心血管系統(tǒng)損害，最終導致心功能惡化乃至心衰〔4～6〕。本項目研究了MMP-2基因啟動子區(qū)-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，并探討其與河南漢族群體慢性充血性心力衰竭(CHF)發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科2010年12月至2011年12月收治的120例CHF患者作為病例組(心衰組)。其中男72例，女48例，年齡58～79〔平均(62.1±10.5)〕歲。與心衰組同期住院的非心衰心臟病患者，共收集136例，其中男78例，女58例，年齡46～78〔平均年齡(60.7±8.8)〕歲，亦排除血液疾病、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全等疾病。所有入選對象均簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 多功能電泳儀(Phannacia公司，瑞典)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)、UV-1240核酸蛋白分光光度計(島津公司，日本)、臺式高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)、PCR儀(Biometra公司，德國)Taq 酶 (上海生物工程有限公司)、MMP-2基因SNPs位點擴增引物 (Invitrogen生物公司上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)、限制性內(nèi)切酶Hha Ⅰ、BspH Ⅰ、Ade Ⅰ(西班牙MBI生物公司)。

1.3研究方法

1.3.1資料收集 所有入選對象均由經(jīng)統(tǒng)一培訓的住院醫(yī)師、研究生填寫自制統(tǒng)一格式的調(diào)查表，然后由2名監(jiān)督員對每1份調(diào)查表進行檢查、審核，有錯誤者補充漏項、糾正錯誤。

1.3.2生化指標測定 受試者經(jīng)10 h過夜空腹，取凌晨6：00空腹靜脈血8 ml，其中3 ml用于血脂等生化指標測定、5 ml用于外周血白細胞的DNA提取。血生化指標檢測由新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院檢驗科采用現(xiàn)行標準化方法完成并統(tǒng)一進行質(zhì)量控制。

1.3.3基因組DNA的提取與定量 采用常規(guī)酚/氯仿法提取血樣中的基因組DNA，采用UV-260紫外分光光度儀(日本島津公司)計檢測DNA的質(zhì)與量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4SNPs目的片段擴增 PCR反應體系：總體積為25 μl，含10×緩沖液 2.5 μl、25 mmol/L Mg2+1.5 μl、2 mol/L dNTP 1 μl、10 mmol/L Primers 2 μl、Taq DNA 聚合酶1 U、基因組DNA(10～100 ng)3 μl、ddH2O 14.6 μl。 熱循環(huán)參數(shù)94℃預變性2 min，94℃變性30 s，退火45 s(各SNPs引物序列及退火溫度見表1)，72℃延伸45 s，36個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

表1 MMP-2基因3個SNPs位點擴增引物序列、退火溫度及限制性內(nèi)切酶

1.3.5SNPs等位基因分型 對PCR產(chǎn)物進行酶切，采用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法鑒定SNPs的等位基因及基因型，各SNPs所用限制性內(nèi)切酶見表1。酶切反應體系為：PCR產(chǎn)物5.0 μl，內(nèi)切酶1 U，10×酶切緩沖液1.0 μl，純水補足總體積至10 μl，37℃水浴10 h；酶切產(chǎn)物取3.0 μl上樣，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行檢測，恒壓200 v，1 h，電泳同時加入100 bp DNA Marker以及PCR擴增產(chǎn)物(未酶切)做內(nèi)參。

1.4統(tǒng)計學方法 將各組基因型及等位基因輸入Excel表格，采用病例對照分析并運用SHEsis軟件〔7〕進行病例與對照組間頻數(shù)及頻率分布比較、HarDY-Weinberg平衡檢驗、單體型推斷、相對危險度(OR)及95%置信區(qū)間(CI)計算。

2 結(jié) 果

2.1一般特征 兩組患者性別構(gòu)成及年齡無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，心衰組血尿酸(UA)水平明顯升高，吸煙比例以及各項血脂水平都顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.2MMP-2基因上3個SNPs與CHF的相關(guān)性

2.2.1PCR-RFLP結(jié)果及基因型分析 MMP-2-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs位點引入的酶切位點及內(nèi)切酶見表3。根據(jù)電泳出現(xiàn)條帶判定基因型。各位點等位基因電泳圖譜如圖1，實際操作中以帶型集中區(qū)照相判讀。

表2 兩組一般情況比較

2.2.2兩組各SNPs等位基因和基因型頻率分布 MMP-2-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs位點的等位基因及基因型頻率在CHF和對照人群中均符合HarDY-Weinberg平衡(P>0.05)。MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs多態(tài)性與CHF的相關(guān)性如表4、表5所示。與對照組相比，CHF組MMP-2-1575G/A的A等位基因和GA基因型的頻率顯著降低(P<0.001)，OR=0.08〔95%CI(0.019～0.039)〕<1。MMP-2-790G/T的T等位基因頻率顯著增加(P<0.001)，OR=1.989〔95%CI(1.337～2.959)〕>1；TT基因型頻率與對照組相比也顯著增加(P<0.05)。MMP-2-1059G/A SNP位點等位基因與基因型頻率在兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，OR=1.129〔95%CI(0.772～1.651)〕。

表3 MMP-2基因3個SNPs位點等位基因判斷及內(nèi)切酶

2.2.3MMP-2單體型分析 用SHEsis軟件統(tǒng)計分析，推斷出MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A和-790G/T 3個SNPs位點在CHF組和對照組分別有7種、6種單體型，其中單體型GAG、GAT、GGG、和GGT在CHF組和對照組頻率均(P>0.01)。進一步對4種頻率>l%的單體型兩組間進行比較，GGG和GGT單體型的頻率在CHF組和對照組中存在顯著差異(P<0.01)，其中GGT單體型OR=1.802〔95%CI(1.265～2.569)〕>1。見表6。

M：DNA Marker；1、2、3、5、6、7、8、9、10：GG；4：GA M：DNA Marker；1、2、3、8：GA；4、5、6、7：GG；9：AA M：DNA Marker；1、2、4、5：GT；3、6：TT；7、8：GG

表4MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因和基因型頻率分布〔n(%)〕

1)P<0.001；2)P<0.05；下表同

表5 MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因頻率分布及OR值

表6 MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因和基因型頻率分布

3 討 論

心力衰竭的病理生理機制主要與心肌重構(gòu)和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活兩大因素有關(guān)，細胞外基質(zhì)(ECM)在心肌重構(gòu)中的作用已得到公認。MMPs對降解ECM有重要作用，近年研究表明，MMPs的表達及活性增強參與許多心血管疾病的發(fā)展過程〔8〕。

MMP-2在內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、心肌細胞等大部分結(jié)締組織細胞中都有基礎表達，有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2水平與心力衰竭過程中的左室擴張和功能不全有關(guān)。實驗室研究也證實MMP-2活性升高與心肌缺血再灌注損傷中的心肌頓抑有關(guān)，并可以直接損傷心肌收縮力〔9〕。某些MMP-2亞型基因啟動子區(qū)的多態(tài)性可以影響到轉(zhuǎn)錄因子與這一區(qū)域的結(jié)合，進而影響整個轉(zhuǎn)錄效率。已有研究證實MMP-2啟動子區(qū)多態(tài)性位點與心力衰竭存在相關(guān)性〔2，9〕。本研究提示A等位基因可能降低個體CHF危險?；蚬δ苎芯刻崾綧MP-2 -1575G/A位點處于雌激素受體結(jié)合位點的5′側(cè)，-1575G表現(xiàn)出增強子的功能，而-1575A轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。因此，MMP-2- 1575G等位基因可以增加MMP-2的表達，進而產(chǎn)生破壞ECM、心肌頓抑和直接損害心肌肌原纖維的作用，1575A等位基因則降低MMP-2轉(zhuǎn)錄活性，減少表達，減輕了上述不良影響，因而降低了收縮性心力衰竭的易感性〔10〕。

在河南漢族群體中，兩組比較，MMP-2啟動子-790G/T 的T等位基因頻率顯著增加。本研究結(jié)果與Vasku等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在CHF的患者中，MMP-2 -790T/G的T等位基因頻率顯著增加一致，說明MMP-2-790G/T 的T等位基因頻率顯著增加可能會增加個體CHF的患病風險。用SHEsis軟件統(tǒng)計分析，推斷出MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A和-790G/T 3個SNPs位點的單體型GAG、GAT、GGG、和GGT在心衰組和對照組頻率均>0.01，其中GGG和GGT單體型的頻率在病例和對照組中存在顯著差異(P<0.05)， GGT單體型OR值>1，說明GGT單體型可能增加CHF的危險性。

本研究結(jié)果表明，在河南漢族人群中，MMP-2基因1575G/A 位點A等位基因可能會降低CHF的患病風險；MMP-2-790G/T 的T等位基因以及MMP-2基因啟動子區(qū)-1575 G/A、-1059G/A、-790G/T位點所組成的GGT單體型都可能增加CHF的患病風險；而MMP-2基因-1059G/A多態(tài)性在河南漢族人群中可能與CHF的易感性無關(guān)。

4 參考文獻

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