馬廣友 李俊杰 邵珠福

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

研究表明，Dukes A、B期大腸癌患者術(shù)后5年生存率可達73.3%～82.6%〔1〕，及早發(fā)現(xiàn)、及早治療可以爭取到更好的治療效果，提高患者的預(yù)后。然而，目前大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療均不理想，誤診率可高達60%～70%，目前臨床上確診的Dukes A期大腸癌患者僅占10%左右〔2，3〕，多數(shù)患者確診時已經(jīng)為晚期，失去了治療的最佳時機。因此，大腸癌的早期診斷和早期治療是重要的防治研究方向。腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管生成，抑制腫瘤的血管生成可以顯著抑制腫瘤的生長。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在評估患者的治療效果和預(yù)后中有重要作用。生長抑制因子(ING)家族是一類腫瘤抑制基因，能夠抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡〔4〕，其在抗腫瘤中的作用及機制越來越受到重視。因此，本研究通過檢測VEGF和ING-4在大腸癌組織中的表達，探討二者在大腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2008年5月至2010年3月收治的經(jīng)手術(shù)病理證實的68例大腸癌患者，均有完整的臨床資料及隨訪資料。68例患者中，男性41例，女性27例；年齡37～79歲，平均(58.3±2.9)歲；結(jié)腸癌30例，直腸癌38例；高分化腺癌17例，中分化腺癌38例，低分化腺癌5例，黏液腺癌8例；Dukes分期：B期15例，C期31例，D期22例。選擇同期20例經(jīng)病理證實的大腸腺瘤及20例經(jīng)病理檢查為正常的腸黏膜組織作為對照。

1.2免疫組化檢查 所有組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片，采用S-P二步法檢測各組織VEGF及ING-4蛋白的表達。采用兔抗人VEGF及ING-4蛋白多克隆抗體(Santa Cruz公司)，工作濃度為1∶50，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照、已知陽性切片作為陽性對照。

1.3結(jié)果判斷 所有病理切片由2名病理科醫(yī)師在未知受檢者情況的前提下閱片，每張切片取5個400倍視野觀察，每個視野計數(shù)100個細胞，記錄陽性細胞數(shù)。ING-4蛋白以細胞核呈棕褐色為陽性細胞，VEGF蛋白以細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)呈棕褐色為陽性細胞。采用半定量法確定染色強度，無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；陽性細胞≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別記為0、1、2、3、4分。總分=陽性細胞染色強度評分+陽性細胞評分，0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分()，6分以上()；≤3分為弱表達，≥4分為強表達〔5〕。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法分析患者的生存情況，采用Gehan比分檢驗比較患者的生存率。

2 結(jié) 果

2.1VEGF及ING-4蛋白在不同大腸組織中的表達 由表1可見，VEGF蛋白在大腸癌組、大腸腺瘤組及正常組中的陽性表達率依次下降，大腸癌組VEGF蛋白陽性率顯著高于大腸腺瘤組和正常組(χ2=11.24、18.91，P<0.05、P<0.01)；大腸腺瘤組VEGF蛋白陽性率也高于正常組(χ2=7.33，P<0.01)。ING-4蛋白在大腸癌組、大腸腺瘤組及正常組中的陽性表達率依次升高，大腸癌組ING-4蛋白陽性率顯著低于大腸腺瘤組和正常組(χ2=4.60、8.71，P<0.05)；大腸腺瘤組ING-4蛋白陽性率也低于正常組(χ2=3.62，P<0.05)。

表1 VEGF及ING-4蛋白在不同大腸組織中的陽性表達差異〔n(%)〕

2.2大腸癌患者VEGF及ING-4蛋白陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系 VEGF蛋白在浸潤漿膜外層的大腸癌組陽性率顯著高于浸潤肌層及漿膜層者(χ2=6.73，P<0.05)，在Dukes C、D期大腸癌患者中的陽性率高于A、B期者(χ2=11.82，P<0.05)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=5.00，P<0.05)，提示VEGF蛋白陽性表達可能與大腸癌的浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。ING-4蛋白在高、中分化大腸癌組陽性率顯著高于低分化組(χ2=4.61，P<0.05)，在Dukes A、B期大腸癌患者中的陽性率高于C、D期(χ2=12.03，P<0.05)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=17.00，P<0.05)，提示ING-4蛋白陽性表達可能與大腸癌的分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表2。

表2 大腸癌患者VEGF及ING-4蛋白陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3VEGF及ING-4蛋白表達與大腸癌患者生存期的關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，VEGF陽性大腸癌患者3年生存率及5年生存率均顯著低于陰性患者(U=23.57，P<0.05)；ING-4陽性大腸癌患者3年生存率及5年生存率均略高于陰性患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=0.06，P>0.05)。見表3。

表3 VEGF及ING-4蛋白表達與大腸癌患者生存期的關(guān)系(%)

3 討 論

研究表明，腫瘤的持續(xù)生長依賴新生血管的形成〔6，7〕，腫瘤新生血管能夠為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)，而且也是腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的直接途徑。腫瘤細胞所分泌的多種血管生長因子能夠誘發(fā)內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖和遷移，其中VEGF是最重要的促血管生長因子之一。

本研究結(jié)果提示大腸癌組織中VEGF蛋白表達被上調(diào)。VEGF蛋白在浸潤漿膜外層的大腸癌組陽性率顯著高于浸潤肌層及漿膜層者，在Dukes C、D期大腸癌患者中的陽性率高于A、B期者，與Kumar等〔8〕的研究結(jié)果一致，而VEGF在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示VEGF蛋白陽性表達可能與大腸癌的浸潤深度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。其可能的機制為：VEGF通過與內(nèi)皮細胞上的特異性受體結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和毛細血管袢形成，進而產(chǎn)生血漿纖維酶原激活劑和膠原酶〔9〕，從而促進血管生成，并促使癌細胞脫落進入血管，或者向鄰近組織擴散，促進腫瘤發(fā)生浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移。

ING-4是由Shiseki等〔10〕于2003年首次分離得到的生長抑制因子家族的新成員，是一種抑制腫瘤發(fā)生的重要因子，可以抑制低氧誘導(dǎo)因子-1的活性，同時促進細胞凋亡、阻滯細胞周期，從而抑制腫瘤的增殖〔11〕。ING-4在腦膠質(zhì)瘤、肺癌等惡性腫瘤中均呈低表達〔12，13〕。

本研究中，大腸癌組織中ING-4蛋白表達顯著低于大腸腺瘤組織和正常腸黏膜組織，提示大腸癌組織中ING-4蛋白的表達被下調(diào)。大腸癌組織中ING-4蛋白的缺失使體內(nèi)的脯氨酸羥化酶-2不能抑制低氧誘導(dǎo)因子-1的活性，弱化了細胞凋亡作用，同時腫瘤細胞周期失去調(diào)控，從而導(dǎo)致腫瘤細胞無限增殖。ING-4蛋白在高、中分化大腸癌組陽性率顯著高于低分化組，在Dukes A、B期大腸癌患者中的陽性率高于C、D期，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示ING-4蛋白陽性表達可能與大腸癌的分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本組ING-4蛋白以中分化大腸癌組陽性率最高，可能與本組納入研究對象中分化患者所占比例最多有關(guān)，但ING-4蛋白在高、中分化大腸癌組陽性率顯著高于低分化組，提示ING-4蛋白陽性表達與大腸癌的分化程度有關(guān)。目前ING-4蛋白表達缺失與腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用機制尚未完全闡明，還需進一步深入研究。

Kaplan-Meier分析顯示，VEGF陽性大腸癌患者3年生存率及5年生存率均顯著低于陰性患者，而ING-4陽性大腸癌患者3年生存率及5年生存率較陰性患者并無顯著差異，提示VEGF可能是提示大腸癌患者預(yù)后的一個重要指標(biāo)〔14〕，而ING-4不是影響大腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

4 參考文獻

1蔡善榮，鄭 樹，張?zhí)K展.不同年齡組大腸癌預(yù)后多因素分析的比較〔J〕.中華腫瘤雜志，2005；27(8)：483-5.

2李 芳.50歲以上無癥狀大腸癌的篩查與早期防治〔D〕.河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.

3Labianca R，Nordinger B，Beretta D,etal.Primary colon cancer：ESMO clinical practice guidelines for diagnosis，adjuvant treatment and follow-up〔J〕.Ann Oncol，2010；21(suppl 5)：70-7.

4Nagashima M，Shiseki M，Pedeux RM,etal.A novel PHD finger motif protein，p47ING3，modulates p53-mediated transcription，cell cycle control，and apoptosis〔J〕.Oncogene，2003；22(3)：343-50.

5何春年，徐翠清，趙煥芬，等.在子宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗癌組織中CyclinE、Rb基因表達的研究〔J〕.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2007；16(3)：330-5.

6Hsu AW，Sodhi A，Eberhart C,etal.Regression of choroidal neovascularization in response to systemic chemotherapy for cancer〔J〕.Canadian J Ophthalmol，2013；48(4)：e80-2.

7Nunez-Cruz S，Gimotty PA，Guerra MW,etal.Genetic and pharmacologic inhibition of complement impairs endothelial cell function and ablates ovarian cancer neovascularization〔J〕.Neoplasia，2012；14(11)：994-1004.

8Kumar H，Heer K，Lee PW,etal.Preoperative serum vascular endothelial growth factor can predict stage in colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，1998；4(5)：1279-85.

9朱慰祺.血管內(nèi)皮生長因子與大腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中國實用外科雜志，2000；20(2)：124-5.

10Shiseki M，Nagashima M，Pedeux RM,etal.p29 ING4 and p28 ING5 bind to p53 and p300，and enhance p53 activity〔J〕.Cancer Res，2003；63(10)：2373-8.

11趙大航，王保新，王文波.生長抑制因子-4抗腫瘤作用〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2012；39(6)：422-4.

12Klironomos G，Bravou V，Papachristou DJ,etal.Loss of ING4 is implicated in the pathogenesis and progression of human astrocytomas〔J〕.Brain Pathol，2010；20(2)：490-7.

13Wang QS，Li M，Zhang LY,etal.Down-regulation of ING4 is associated with initiation and progression of lung cancer〔J〕.Histopathology，2010；57(2)：271-81.

14武鴻斌，宋 燕，謝忠士，等.PTEN與VEGF在大腸癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2008；28(5)：473-4.