孫 曼 蔣軍廣 張曉燕 史 江 安金路 楚玉潔 崔永亮 張艷梅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

肺癌發(fā)病率、死亡率逐年增高。細(xì)胞凋亡異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。凋亡抑制基因、凋亡促進(jìn)基因及凋亡效應(yīng)基因的上調(diào)及下調(diào)，都可能打破細(xì)胞生成與死亡的平衡。腫瘤即為此平衡打破后所造成的細(xì)胞異常增殖與死亡。近年來對(duì)凋亡相關(guān)基因的研究越來越多〔1～3〕，但對(duì)半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)在細(xì)胞凋亡中的作用研究尚少。本文主要研究caspase-3在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)家 隨機(jī)選取我院2009～2011年經(jīng)外科切除的NSCLC標(biāo)本60例。年齡36～87〔平均(58.9±17.2)〕歲。所有病人在術(shù)前均未接受化、放療，病理診斷明確。TNM分期按照美國(guó)聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的分期標(biāo)準(zhǔn)，其中男40例，女20例，鱗癌30例，腺癌30例。高分化15例，中低分化45例。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和四期共21例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。有胸腔積液11例，無胸腔積液49例。另設(shè)20例對(duì)照組，為癌旁5 cm以外的正常組織(經(jīng)病理證實(shí))，所有標(biāo)本均為蠟塊包埋，由專業(yè)人員切片，3片/例。

1.2方法

1.2.1主要試劑 Rabbit Anti-Caspase-3 來自北京博奧森生物技術(shù)公司；凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)羅氏公司；SP9000試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，購(gòu)自北京中杉生物工程公司。

1.2.2免疫組化染色 所選的60例肺癌組織及20例正常肺組織常規(guī)切片，隨即放入60℃烤箱內(nèi)烘烤3 h， 切片脫蠟至水，將切片放入裝有抗原修復(fù)液的缸子中，放入微波爐高溫5 min，低溫10 min后取出進(jìn)行抗原修復(fù)，過氧化物酶(POD)阻斷劑阻斷內(nèi)源性POD活性；非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng)；滴加一抗；加生物素標(biāo)記的二抗；滴加辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素； DAB顯色；蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水；中性樹膠封片。

1.2.3細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 將切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K，滴加DNA末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)反應(yīng)混合液，滴加POD轉(zhuǎn)換劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.2.4caspase-3陽性結(jié)果判定 caspase-3染色為細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。首先判定顏色，觀察所有片子的染色，無染色(與背景染色無明顯差別)計(jì)為0分，淺染色(細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染為淺棕黃色，與背景顏色有差別)為1分，染為棕黃色(1～3分)為2分，染為深棕黃色(與背景顏色差別顯著)為3分。第二看染色細(xì)胞比例，高倍鏡(400倍)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每張切片數(shù)5個(gè)視野，陽性細(xì)胞數(shù)占總癌癥細(xì)胞百分比。0%為0分，0%～10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。將以上所得分值相加為總分值，總分值<4為陰性表達(dá)，≥4為陽性表達(dá)。

1.2.5凋亡細(xì)胞的陽性結(jié)果判定 凋亡細(xì)胞經(jīng)TUNEL法處理后，細(xì)胞核被染為棕黃色，使用光學(xué)顯微鏡，計(jì)數(shù)每1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)，進(jìn)行分析。排除有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶的區(qū)域，以免造成假陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正的χ2檢驗(yàn)，caspase-3與凋亡的關(guān)系采用直線相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1caspase-3表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 經(jīng)免疫組化染色后，細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，肺癌組織60例，陽性率為40%，正常肺組織20例，陽性率為40%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P=1.000)。表1可見，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率(7.4%)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(66.7%)低(χ2=21.728，P=0.000)。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期陽性率(56.4%)高于Ⅲ 期和Ⅳ期陽性率(9.5%)(χ2=12.50，P=0.000)。caspase-3表達(dá)與年齡、性別、病理分型、分化程度、胸腔積液、腫瘤直徑、吸煙、腫瘤生長(zhǎng)部位無明顯關(guān)系(P>0.05)。

表1 NSCLC中caspase-3的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.2caspase-3與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系 caspase-3積分與凋亡指數(shù)(AI)呈正相關(guān)(r=0.834,P=0.000)。其中0分AI值3.67±0.59,1～2分為5.31±1.67，3～4分為7.47±1.34,5～6分為10.65±1.47。

3 討 論

caspase-3為caspase家族中的重要組成成員，caspase在細(xì)胞凋亡中處于核心位置，其被上游信號(hào)激活后發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-3途徑為大多數(shù)凋亡途徑必不可少的，它的表達(dá)下調(diào)或缺失能影響多個(gè)因子對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3的表達(dá)異常與肝癌、宮頸癌、食管癌、胃癌等〔4～7〕多種腫瘤的發(fā)生均密切相關(guān)。夏鈺弘等〔8〕通過對(duì)肝癌的研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與腫瘤的分期有明顯相關(guān)性，其表達(dá)越低，肝癌的惡性程度越高。夏麗〔5〕的研究證實(shí)caspase-3高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)要高于低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而推測(cè)caspase-3的低表達(dá)很可能促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Sun等〔9〕研究提示caspase-3表達(dá)的下調(diào)或缺失與胃癌的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在食管癌發(fā)生的早期受到抑制,后期存在其他途徑反饋激活。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與鄭春晨等〔10〕報(bào)道不一致，與洪江〔7〕研究的結(jié)論相似。考慮為肺癌組織在發(fā)生發(fā)展中不但存在過度增殖，也存在大量凋亡。而增殖的速度遠(yuǎn)大于凋亡。caspase-3在NSCLC中的表達(dá)與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān)。提示caspase-3的表達(dá)下調(diào)與缺失在腫瘤的早期轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。另外，本研究提示caspase-3的表達(dá)下調(diào)有益于臨床分期，患者預(yù)后不好。這在李承慧等〔11〕的研究中也得到了證實(shí)。caspase-3與凋亡呈正相關(guān)，提示基因下調(diào)或缺失導(dǎo)致凋亡減少，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示在NSCLC患者中修復(fù)此基因會(huì)對(duì)治療有幫助，為NSCLC治療提供了新的靶點(diǎn)。

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