孟繁娟 劉賢英 祁盛昆

(長春市人民醫(yī)院，吉林 長春 130051)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率有逐漸年輕化趨勢〔1〕。目前，多采取放射治療、化療及生物治療為主的綜合治療。但是，熱療與生物治療聯(lián)合應(yīng)用，近年來倍受關(guān)注，并取得了臨床治療效果〔2〕。本研究應(yīng)用人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)細(xì)胞為靶點(diǎn)，觀察葡萄球菌腸毒素A(SEA)聯(lián)合熱療對Hela細(xì)胞生物為行為影響，為人宮頸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑 Hela細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時進(jìn)行分組，單純熱療組(43±0.2)℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)；單純SEA組，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果SEA最適量為40 ng/ml；聯(lián)合組在單純SEA組基礎(chǔ)上再加熱(43±0.2)℃ 40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測量各孔吸光度A值，Hela細(xì)胞抑制率=(1-實驗組細(xì)胞A值÷對照組細(xì)胞值)×100%。對照組A組1.52±0.12，熱療組A值1.24±0.14，抑制率18.4%，SEA組A值1.12±0.16，抑制率26.4%，聯(lián)合組A組0.81±0.20，抑制率46.8%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞周期結(jié)果以Modiff 2.0軟件分析，組間比較采用F檢驗。見表1。

1.2.3透射電子顯微鏡技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.2收集不同條件下作用過的Hela細(xì)胞。移入椎形離心管內(nèi)，離心棄上清，應(yīng)用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，遞度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1MTT結(jié)果 不同條件下對Hela細(xì)胞增殖均有抑制作用，組間比較差異顯著，但聯(lián)合組效果顯著。

2.2流式細(xì)胞儀結(jié)果 不同條件下對Hela細(xì)胞增殖周期各時相均有影響。G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，組間比較差異顯著。見表1。

表1 不同條件下對Hela細(xì)胞周期進(jìn)程影響及凋亡率(n=6)

2.3透射電子顯微鏡結(jié)果 不同條件下對Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞高度空化，線粒體腫脹，細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊凝集，可見凋亡小體。

3 討 論

宮頸癌的主要生物學(xué)特點(diǎn)是腫瘤生長速度相對緩慢，以直接浸潤為主，很少向?qū)m體縱向浸潤〔3〕。宮頸癌向輸卵管及卵巢轉(zhuǎn)移不超過1%。根據(jù)宮頸癌上述生物學(xué)特點(diǎn)及臨床實踐驗證，宮頸癌更適合生物治療及物理治療。MTT實驗可準(zhǔn)確反映活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活化狀態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選及細(xì)胞毒性的實驗研究，具有一定的客觀性。

文獻(xiàn)報道〔4〕，熱療可改變細(xì)胞周期兩個調(diào)控點(diǎn)，一個位于G1→S轉(zhuǎn)折點(diǎn)，控制細(xì)胞生長前期(G1期)進(jìn)入DNA合成期(S期)，另一調(diào)控點(diǎn)位于G2→M期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。結(jié)果顯示，熱療可抑制G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映〔5〕。本研究應(yīng)用SEA聯(lián)合熱療觀察其對Hela細(xì)胞的生物學(xué)改變，SEA是一組對熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用。是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔6〕。SEA殺傷腫瘤細(xì)胞有兩種途徑，直接的細(xì)胞毒效應(yīng)和間接的殺傷腫瘤細(xì)胞，不需加工直接與MHC I類分子結(jié)合形成，通過配體抑制細(xì)胞增殖，由于SEA對熱穩(wěn)定，所以聯(lián)合熱療應(yīng)用優(yōu)于化學(xué)藥物，因此具有廣闊應(yīng)用前景。此外，本研究還應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察不同條件下對Hela細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，可見細(xì)胞線粒體腫脹，有空泡形成，核染色質(zhì)趨邊凝集，可見凋亡小體。

綜上，SEA聯(lián)合熱療具有直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，尤其是宮頸癌屬于腔內(nèi)淺表腫瘤，可直接宮腔內(nèi)灌注殺傷腫瘤細(xì)胞，又便于直接排出體外，避免毒副作用的產(chǎn)生。因此，SEA聯(lián)合熱療用于婦科腫瘤的治療有廣闊前景。

4 參考文獻(xiàn)

1金 梅，章根琴，費(fèi)小陽.早期子宮頸癌患者保留生育功能的經(jīng)腹根治性子宮頸切除術(shù)4例臨床分析〔J〕.實用腫瘤雜志，2012；7(4)：439-40.

2高 惠，楊耀琴.熱療與生物治療的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2009；36(3)：193-5.

3王曉麗，趙衛(wèi)東.根治性宮頸切除術(shù)在浸潤性宮頸癌中的應(yīng)用〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2013；40(7)：539-41.

4lim CU，Zhang Y，F(xiàn)ox MH，etal.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia，2006；22(1)：77-91.

5Thomas D，Chou S，Dauwalder O，etal.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007；93(3)：24-41.

6Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，etal.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2005；5(6)：491-8.