黃贊松 向發(fā)良 周喜漢 黃衍強 鄧志華 仇儀英

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

肝癌的發(fā)生、發(fā)展與微小RNA(miRNA或MicroRNA)的異常表達有關(guān)，其中在肝癌中表達上調(diào)，行使癌基因的功能，被稱為“腫瘤miRNA”(OncomiRs)〔1，2〕，如MicroRNA-21作為一個原癌miRNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3〕；另一部分miRNA 則行使抑癌基因的功能。目前，肝癌的治療仍以綜合治療為主，但放、化療毒副作用大，中藥能降低化療藥物的毒副作用，增強人體免疫力，提高患者生存質(zhì)量和延長生命所體現(xiàn)的優(yōu)勢，彌補了現(xiàn)代醫(yī)學腫瘤治療方法的不足〔4〕苦參素是苦豆子等中草藥活性成分的提取物，具有抗肝癌的作用〔5〕，但其抗肝癌的作用機制未完全闡明。本實驗研究不同濃度苦參素(Oxymatrine或OM)抗肝癌的作用，同時研究苦參素對HepG2細胞中MicroRNA-122、MicroRNA-21表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HepG2細胞株購自中科院上海細胞庫。并在含10%小牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的RPMI21640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(MCO-18AIC CO2)內(nèi)培養(yǎng)?？鄥⑺刈⑸湟?.6 mg/mL，購于湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。小牛血清購于GIBCO公司(北美洲)，RPMI21640培養(yǎng)液及胰酶均購于北京索萊寶科技有限公司。MTT配制成5 mg/ml，過濾除菌分裝備用。miRcute miRNA 提取試劑盒(目錄號：DP501)、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(目錄號：KR201)、miRcute miRNA熒光定量試劑盒(目錄號：FP401)均購于天跟生化科技(北京)有限公司。MicroRNA-122、MicroRNA-21、U6(目的序列與內(nèi)參序列具有相同的擴增效率)引物均購于天跟生化科技(北京)有限公司。儀器BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜，MCO-18AIC CO2恒溫培養(yǎng)箱，全自動酶標儀Multiskan MK3，倒置顯微鏡，臺式高速冰凍離心機1-15PK，微型離心機UniForce6K，RT-PCR儀IQ5，凝膠成像儀。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測不同濃度苦參素作用HepG2細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細胞，制成細胞懸液，以5×104/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μl細胞懸液，分為實驗組苦參素組、陰性對照組和空白對照組，陰性對照組加細胞懸液，不加藥物；空白對照組只加培養(yǎng)液，不加細胞和藥物。每組設(shè)8個復孔。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后加入預先配制好的含苦參素的培養(yǎng)液100 μl/孔，使其終濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/ml；向陰性對照組和空白對照組加入培養(yǎng)液100 μl/孔。將培養(yǎng)板放置CO2孵育箱中分別孵育48、72 h。分別于44、68 h時向苦參素組、陰性對照組和空白對照組加入5 mg/ml MTT 15 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μl，然后置于恒溫振蕩箱中，37℃、100 rpm，振蕩10 min。在全自動酶標儀上于490 nm波長處測定光密度(OD)值，用復孔平均OD值進行比較，計算腫瘤細胞抑制率(IR)。以藥物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制濃度效應(yīng)曲線，求回歸方程，得出50%抑制濃度(IC50)。

1.2.2實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測MicroRNA-122和MicroRNA-21的表達

1.2.2.1細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期細胞，制成細胞懸液，取等量細胞接種于兩個新的培養(yǎng)瓶中，吹打混勻，然后置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，1瓶細胞予常規(guī)換液處理作為未加藥的陰性對照組，另1瓶細胞予換含IC50OM(根據(jù)回歸方程，求得OM作用于HepG2細胞72 h IC50為3.2 mg/ml)培養(yǎng)液處理作為加藥的OM實驗組。分別做好標記，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2.2細胞總RNA的提取及RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR檢測 根據(jù)天跟公司試劑盒進行RNA 提取和RNA逆轉(zhuǎn)錄,之后在實時PCR儀上進行擴增，操作步驟均按照試劑盒說明完成，使用Real time PCR進行檢測MicroRNA-122和MicroRNA-21的表達，以U6作為內(nèi)參,分管同機進行PCR反應(yīng)。陰性對照組與OM實驗組反應(yīng)同機進行，重復實驗3次。相對定量分析2-△△CT

1.2.2.3瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產(chǎn)物 按一定(上樣緩沖液：DNA樣品=1∶5)的比例(體積/體積)加入1.5%的瓊脂糖凝膠跑膠，條件為：80 V，30 min。停止電泳。取膠置于凝膠成像儀中進行觀察和照相。

2 結(jié) 果

2.1苦參素對肝癌HepG2細胞增殖的影響 不同濃度苦參素作用肝癌HepG2細胞48 h、72 h后，發(fā)現(xiàn)苦參素對肝癌細胞增殖抑制率藥物濃度的增加及作用時間延長顯著增加(P<0.05，P<0.01)，但低濃度0.5 mg/ml OM作用48 h、72 h時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，故認為0.5 mg/ml OM組對肝癌HepG2細胞無增殖抑制作用。OM各濃度組作用48 h和72 h差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 苦參素對HepG2細胞增殖的影響

72 h對照組

3.2 mg/ml OM作用72 h

2.2Real-time PCR法檢測苦參素對HepG2細胞MicroRNA-122及MicroRNA-21表達的影響 OM實驗組MicroRNA-122的表達為陰性對照組的2.79倍，MicroRNA-122表達上調(diào)。OM實驗組MicroRNA-21的表達為陰性對照組的0.44倍，MicroRNA-21表達下調(diào)。

2.3MicroRNA-122和MicroRNA-21 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Real-time PCR反應(yīng)后為進一步驗證擴增產(chǎn)物，予行瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)，MicroRNA-122、MicroRNA-21及U6均見單一清晰條帶，無雜帶和拖尾現(xiàn)象，說明產(chǎn)物特異性好，無非特異性擴增和引物二聚體。

1：Marker；2：OM實驗組MicroRNA-122；3：陰性對照組MicroRNA-122；4：陰性對照組U6；5：OM實驗組U6；6：陰性對照組MicroRNA-21；7：OM實驗組MicroRNA-21；8：陰性對照組U6；9：OM實驗組U6

3 討 論

苦參素是苦豆子等中草藥活性成分的提取物，主要含有氧化苦參堿和極少量氧化槐果堿的混合物，其中氧化苦參堿含量在98%以上，又名氧化苦參堿〔6，7〕。近年來其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，以抗肝細胞腫瘤為甚，本研究發(fā)現(xiàn)苦參素對小鼠肝移植瘤有抑制作用〔8〕。有多項研究表明苦參素有抗腫瘤作用〔9～11〕，可通過抑制腫瘤細胞DNA的合成、抑制相關(guān)酶活性、影響腫瘤細胞的正常周期來抑制腫瘤細胞增殖；通過控制相關(guān)因子的表達來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；前期研究表明苦參素可通過影響與腫瘤相關(guān)基因的表達、影響端粒酶的活性等途徑來誘發(fā)細胞發(fā)生凋亡〔12～14〕。

劉益均等〔15〕采用MTT法觀察不同濃度和不同作用時間下OM對SGC-7901細胞的抑制情況，發(fā)現(xiàn)苦參素藥物濃度達到1 mg/ml以上時,則能顯著抑制細胞的增殖,抑制效應(yīng)隨著時間和濃度的增加呈逐漸增強，提示OM在體外能顯著抑制SGC-7901細胞增殖。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)OM濃度達到1.0 mg/ml以上后對HepG2細胞均有抑制作用，且隨時間增加而抑制作用更顯著，即OM對腫瘤細胞抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性。這與劉益均等研究結(jié)果一致。

MicroRNA(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，大約由20～22個核苷酸構(gòu)成，由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶加工后生成〔16，17〕。它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中。miRNAs主要是與靶mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或直接是mRNA降解，能調(diào)節(jié)多種生物功能〔18〕。有研究〔19〕發(fā)現(xiàn)microRNAs在肝癌組織中異常表達，它們可能參與了肝細胞癌變及肝癌轉(zhuǎn)移的病理過程，包括MicroRNA-21、MicroRNA-122、mir-224、mir-93、mir-200a等〔20～22〕。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)OM實驗組中其表達上調(diào)，OM能提高肝癌細胞內(nèi)的MicroRNA-122的表達，抑制細胞增殖，根據(jù)以往實驗結(jié)果microRNA-122在肝正常組織及癌旁組織中高表達，而在肝癌組織中低表達〔23〕，同時Lin等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 是MicroRNA-122 的一個靶基因，MicroRNA-122 作用于Bcl-2 的3’UTR 后，升高MicroRNA-122能明顯抑制Bcl-2 蛋白的表達，繼而導致細胞活力降低和半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspase-3)活性激活，從而促進了腫瘤細胞的凋亡。OM可能使肝癌細胞中MicroRNA-122表達升高，從而促進腫瘤細胞凋亡。OM能提高MicroRNA-122的表達，這能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞向癌旁組織及正常細胞轉(zhuǎn)化需行大量的動物實驗及臨床試驗進一步研究。

相關(guān)研究表明MicroRNA-21 基因的啟動子受核因子(NF)-κB、激活蛋白(AP)-1〔25〕、NFIB和信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)〔26〕等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。Meng等〔27〕研究小組利用基因芯片技術(shù)對正常肝細胞和肝癌細胞中miRNA 的表達譜進行了分析，結(jié)果顯示MicroRNA-21 在肝癌細胞中比正常細胞高9 倍，并且外源MicroRNA-21 的導入可抑制腫瘤抑制基因磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)的功能，明顯增強肝癌細胞的增值、侵襲及遷移能力，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實驗發(fā)現(xiàn)OM實驗組中MicroRNA-21表達下調(diào)，而細胞數(shù)目減少， MicroRNA-21在HepG2細胞中可能起到癌基因作用，經(jīng)過OM處理后的HepG2細胞中MicroRNA-21表達下調(diào)，其誘導的細胞增殖受到抑制，從而細胞數(shù)目減少。OM可能通過下調(diào)MicroRNA-21的表達從而抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，OM濃度達到1.0 mg/ml以上后對人肝癌細胞株HepG2細胞有明顯抑制作用，且具有時間依賴性和濃度依賴性。OM可上調(diào)HepG2細胞的MicroRNA-122表達，促進腫瘤細胞凋亡，由于本實驗存在局限，OM能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞向正常細胞轉(zhuǎn)化需進一步行動物實驗及臨床研究進一步證實。MicroRNA-21作為癌基因，OM作用后可下調(diào)其表達，說明OM抑制肝癌作用的機制可能與下調(diào)MicroRNA-21表達有關(guān)。

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