王 璟 郭 影 趙向寨 李 萍

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(GTN)包括侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤(pán)部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，是來(lái)源于異常滋養(yǎng)細(xì)胞的腫瘤，多發(fā)于生育期婦女〔1〕。賴氨酰氧化酶(LOX)主要調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，包括5個(gè)成員，其中LOX定位于5q23.3～31.2，是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)基因〔2，3〕。本研究采用RNA干擾技術(shù)，靶向構(gòu)建LOX小干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染人絨癌Bewo細(xì)胞，敲低LOX基因表達(dá)，探討對(duì)人絨癌Bewo細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人絨癌Bewo購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司；LOX siRNA、Control siRNA-A、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Santa Cruz公司；LOX、N-cadherin,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-7抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人絨癌Bewo細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，細(xì)胞經(jīng)10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2飽和度和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，鋪于無(wú)菌6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h至人絨癌Bewo細(xì)胞融合率達(dá)50%，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，換無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液，按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)要求用Transfection regent稀釋LOX siRNA、Control siRNA及轉(zhuǎn)染試劑Transfection medium/regent。實(shí)驗(yàn)分組：正常培養(yǎng)人絨癌Bewo細(xì)胞組(對(duì)照組，Control)、轉(zhuǎn)染LOX siRNA細(xì)胞組(Mock)、轉(zhuǎn)染Control siRNA細(xì)胞組(siRNA)。轉(zhuǎn)染試劑作用6 h，無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，換含10%血清、抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染24 h后，分別搜集細(xì)胞提取總RNA及總蛋白待測(cè)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各蛋白 mRNA水平表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h，提取總RNA，測(cè)定A260/A280值介于1.8～2.0。以β-actin作為內(nèi)參，總RNA 濃度為1 mg/ml進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30個(gè)循環(huán)，內(nèi)參循環(huán)數(shù)設(shè)定為25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢，溶解曲線進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，利用CT值計(jì)算各組LOX mRNA相對(duì)值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列LOX：5′-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3′,5′-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3′；N-cadherin：5′-CAACTTGCCAGAAAA-CTCCAGG-3′,5′-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3′；MMP-2：5′- CTATTCTGCCAGCACTTTGG -3′,5′- CAGACTTTGGTTCTCCAA-CTT -3′；MMP-7：5′-TGGGAACAGGCTCAGGACTATCT-3′,5′-TTCGGGTCTACACCTCACGG-3′；GAPDH ：正義5′-GTACGTCG-TGGAGTCCACTG-3′,反義5′-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3′。

1.4Western印跡法檢測(cè)各目的基因蛋白水平表達(dá) 經(jīng)過(guò) 24 h轉(zhuǎn)染后，分別提取各組細(xì)胞，給予預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于冰上進(jìn)行操作，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，二喹林甲酸(BCA)法蛋白定量，各組取等量細(xì)胞總蛋白于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)至NC膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉1 h， LOX(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)N-cadherin(兔抗1∶250，SANTA CRUZ)、MMP-2(鼠抗1∶500，SANTA CRUZ)、MMP-7(鼠抗1∶300，SANTA CRUZ)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃過(guò)夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶2 000)37℃ 1.5 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色 ，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn) 將給予siRNA處理后細(xì)胞含血清100 ml/L的DMEM培養(yǎng)基懸浮，以2×105接種于Fibronectin包被的Transwell孔板其中的12個(gè)Transwell上，上室加入100 μl/孔，下室加入600 μl含血清200 ml/L的DMEM培養(yǎng)基。 經(jīng)過(guò)24 h后，取出上室，用棉簽蘸去上層的細(xì)胞，加入100 ml/L新鮮配置的甲醛溶液固定30 min，然后用SyTOXGreen染色15 min。甘油封片后用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞通過(guò)情況。平均每小時(shí)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值分析細(xì)胞的穿透能力。

2 結(jié) 果

2.1LOX siRNA 轉(zhuǎn)染后目的基因在蛋白及mRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染LOX siRNA 24 h后LOX 表達(dá)明顯降低，約為對(duì)照組的(36±1.3)%，在mRNA水平明顯降低約為對(duì)照組的(41±2.1)% ，見(jiàn)圖1。

圖1 各組目的基因蛋白表達(dá)情況

2.2LOX siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞N-cadherin、MMP-2、MMP-7蛋白及mRNA水平表達(dá) 轉(zhuǎn)染LOX siRNA 24 h后N-cadherin、MMP-2、MMP-7 表達(dá)明顯降低，分別約為對(duì)照組的(35±2.6)%，(29±0.8)%，(42±1.7)%。在mRNA水平表達(dá)明顯降低，結(jié)果以2-△△CT表示，分別為 0.34±0.213，0.30±0.064，0.45±0.301。見(jiàn)圖2。

A:蛋白表達(dá);B:mRNA表達(dá)

2.3Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變 轉(zhuǎn)染后24 h，siRNA組穿膜細(xì)胞為(41±5)個(gè)，Mock組和Control組分別為(154±6)和(167±5)個(gè)，與Mock組和Control組比較，siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。而Mock組和Control組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

3 討 論

LOX在多種腫瘤中高表達(dá)，其中乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)LOX過(guò)表達(dá)可以改變腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，激活特定通路，上調(diào)MMPs類(lèi)的表達(dá)，從而降解基底膜，使得內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、遷移，出現(xiàn)新生血管，加速乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲〔4〕。細(xì)胞外基質(zhì)膠原和彈力蛋白聚合最初階段的關(guān)鍵酶及細(xì)胞外基質(zhì)形成修復(fù)關(guān)鍵因子均是LOX〔5,6〕，同時(shí)研究〔7〕發(fā)現(xiàn)干擾LOX可以有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。人絨毛膜癌臨床特點(diǎn)具有轉(zhuǎn)移早、侵襲性強(qiáng)，但機(jī)制不明，本研究說(shuō)明MMPs與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，侵襲轉(zhuǎn)移主要通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)〔8,9〕。

綜上，沉默LOX在人絨癌Bewo中的表達(dá)，可明顯降低人絨癌Bewo細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，為人絨毛膜癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

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