劉宏偉 孟 巖 張 劍 姜 偉 王玉清

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

我國(guó)目前就有白內(nèi)障患者500多萬，急需手術(shù)治療的白內(nèi)障盲人就有近200萬，每年新增的白內(nèi)障盲人就有約(40～120)萬，白內(nèi)障目前還沒有明確有效的治療藥物，治療手段主要是手術(shù)治療，而手術(shù)畢竟是一種創(chuàng)傷性治療手段且費(fèi)用較高。研究表明大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，過量表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)〔1〕。本研究擬探討NGF對(duì)白內(nèi)障大鼠的保護(hù)作用及發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 199培養(yǎng)基、小牛血清、外源性NGF、D-木糖、NGF抗體、抗兔二抗均購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司，離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀等由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2動(dòng)物分組 Wistar大鼠40只(由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(180±20)g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、NGF組、對(duì)照組，每組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用10%水合氯醛麻醉并在無菌條件下處死大鼠，并取大鼠眼球，冰冷生理鹽水沖洗后浸入0.1%新潔爾滅溶液1 min，再以新鮮除菌培養(yǎng)液沖洗數(shù)次，然后在無菌操作下解剖眼球取出晶體，分別投入試管中，每個(gè)試管中含液體3 ml，空白對(duì)照組試管中加入199培養(yǎng)液60%，小牛血清40%。模型組試管中加入199培養(yǎng)液60%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%。NGF組試管中加入199培養(yǎng)液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，NGF 40%。對(duì)照組試管中加入199培養(yǎng)液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，生理鹽水40%，加蓋后置于37℃水育箱中培養(yǎng)。分別在24、48、72 h觀察晶狀體渾濁度，并用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定空白對(duì)照組和模型組內(nèi)源性NGF的含量。

1.3晶體渾濁度觀察 按照何守志等〔2〕報(bào)道的方法對(duì)晶狀體混濁程度進(jìn)行分期并計(jì)分：0期：用裂隙燈顯微鏡觀察晶體清晰透明，計(jì) 0分；Ⅰ期：囊泡初期，晶體周邊部皮質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小囊泡或細(xì)小囊泡群，計(jì)1 分；Ⅱ期：囊泡期，晶體皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)細(xì)小囊泡，中等囊泡自赤道部向前皮質(zhì)擴(kuò)展，逐漸形成環(huán)狀或戒指狀，囊泡群環(huán)帶逐漸加寬至前皮質(zhì)的 1/2～ 2/3 半徑，計(jì) 2分；Ⅲ期：皮質(zhì)期，晶體皮質(zhì)呈現(xiàn)不規(guī)則條紋狀、箭竹狀并向前極放射的混濁灶，逐漸形成彌漫性灰色至灰白色混濁，晶體核尚透明，計(jì)3分；Ⅳ期：核混濁期，除晶體皮質(zhì)灰白混濁外，晶體核密度增高，出現(xiàn)致密灰色至乳白色或白色混濁，計(jì)4分；Ⅴ期：成熟白內(nèi)障期，晶狀體皮質(zhì)及核完全呈灰白色混濁，計(jì)5分。

1.4ELISA 利用鼠β-NGF ELISA試劑盒按產(chǎn)品說明書步驟進(jìn)行操作，收集各組晶狀體勻漿上清液，加入預(yù)先包被有NGF多克隆抗體的96孔板內(nèi)，4℃孵育24 h。洗去多余抗體，加入生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG室溫孵育2 h。最后加入終止液，37℃孵育25 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad 680)OD 450 nm處測(cè)量各孔吸光值，系統(tǒng)精密度為最小1.0 ng/ml。每組樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

空白對(duì)照組晶狀體渾濁度分?jǐn)?shù)1分，模型組120分，對(duì)照組112分，NGF組79分。模型組較空白對(duì)照組渾濁度系數(shù)明顯增高(P<0.05)。而NGF組較對(duì)照組渾濁度系數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表1。

模型組24、48、72 h NGF濃度〔(18.951±4.021)、(10.173±11.511)、(6.098±20.001)pg/ml〕均明顯高于空白對(duì)照組〔(0.375±0.021)、(0.897±0.083)、(1.145±1.003)pg/ml〕(P<0.05)。模型組24、48、72 h NGF濃度隨時(shí)間推移而下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠在24、48、72 h晶狀體渾濁度(n=10)

3 討 論

現(xiàn)已公認(rèn)晶狀體透明度的維持是由其組成蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定的，天然蛋白的穩(wěn)定性決定了蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定，蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的維持依賴于新合成多肽的合理折疊和細(xì)胞對(duì)環(huán)境或病理生理應(yīng)激產(chǎn)生的足夠的保護(hù)作用。蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定導(dǎo)致晶狀體的混濁，因而詳細(xì)了解晶狀體蛋白如何長(zhǎng)期維持其天然結(jié)構(gòu)是非常必要的。晶狀體獨(dú)特的解剖位置使其長(zhǎng)期暴露于一種應(yīng)激的環(huán)境中。 由于晶狀體沒有直接的血供，因此一些必不可少的生物大分子如氧或氨基酸的供應(yīng)是有限的，而代謝廢物如毒素、炎性物質(zhì)在附近長(zhǎng)期保留。 所以，晶狀體需要特殊的保護(hù)作用以抵抗微環(huán)境誘導(dǎo)的應(yīng)激。如果沒有這樣的保護(hù)作用，晶狀體蛋白質(zhì)將降解而導(dǎo)致白內(nèi)障。NGF能夠促進(jìn)發(fā)育中的感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元的存活和分化，營(yíng)養(yǎng)成熟神經(jīng)元，維持其正常的生物學(xué)功能，具有抑制細(xì)胞凋亡〔3〕，保護(hù)視神經(jīng)的作用迅速成為生命科學(xué)界所矚目的焦點(diǎn)〔4〕。

本實(shí)驗(yàn)提示NGF可延緩白內(nèi)障的發(fā)生，可以作為白內(nèi)障疾病一種新的治療途徑。NGF在身體各部位都可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，尤其是在機(jī)體受到外界因素干擾時(shí)，含量可增高。機(jī)體自身存在一定的內(nèi)源性NGF，特別是在加入D-木糖后，晶狀體中內(nèi)源性NGF含量也明顯增高，這一現(xiàn)象說明機(jī)體存在一定的自我保護(hù)作用，但其作用較微弱，達(dá)不到抑制晶狀體渾濁的作用。白內(nèi)障的發(fā)生可減少NGF的產(chǎn)生，從而降低NGF對(duì)晶狀體的保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Leppa S，Kajanne R，Arminen L，etal.Differentiation induction of HSP70-encoding genes in human hematopoietic cells〔J〕.J Biochem，2001；276：31713-9.

2何守志，尹素云，宋 深.半乳糖性白內(nèi)障形成及逆轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華眼科雜志，1987;23(1):39-42.

3王麗輝，童坦軍.神經(jīng)生長(zhǎng)因子〔J〕.生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展,1998;19(1)：29.

4Lindsay RM，Hamer AJ.Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons〔J〕.Nature，1989;337：362.