董革輝 劉?；?韓建華 夏本杰 黃俊瓊

(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院骨科，貴州 遵義 363000)

Exosome是細(xì)胞分泌的膜性微囊結(jié)構(gòu)，具有來源細(xì)胞的某些功能蛋白，其功能根據(jù)來源細(xì)胞的不同而不同〔1，2〕。腫瘤細(xì)胞來源的exosome(Texo)富含組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC)-Ⅰ類分子及腫瘤相關(guān)抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答〔3〕。Exosome為亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，無致瘤性，是近年來腫瘤疫苗研究的熱點，但骨肉瘤來源的exosome研究尚未見報道。本實驗采用超濾離心聯(lián)合蔗糖密度梯度超速離心的方法從骨肉瘤細(xì)胞分離exosome，透射電子顯微鏡觀察eoxsome的形態(tài)特征，Western印跡鑒定其表面標(biāo)志物，為進一步研究Texo腫瘤疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實驗材料 小鼠骨肉瘤細(xì)胞(K7M2)購自漢恒生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，兔抗鼠MHC-Ⅰ、CD81抗體分別購自Senta Cruz 和Abcam公司，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為Sigma 公司產(chǎn)品，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒、蛋白預(yù)染Marker購自碧云天生物技術(shù)研究所，細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司，100 Kda Amicon Ultra-15離心超濾管超濾管購自美國Millipore公司，超速離心管及低溫超高速離心機為Beckman公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，待單層細(xì)胞生長達到80%融合時，用胰蛋白酶消化細(xì)胞進行傳代。選取對數(shù)生長期細(xì)胞，收集培養(yǎng)液。

1.3Exosomes的分離與純化 收集骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清200～500 ml，4℃ 300 r/min離心10 min；取上清液4℃ 800 r/min離心30 min；取上清液4℃ 10 000 r/min離心30 min；再取上清液加入100 Kda Amicon Ultra-15離心超濾管，4℃ 1 500 r/min離心30 min，至濃縮液體積<8 ml；將濃縮液、30 g/L蔗糖/重水墊和磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L)按3∶3∶4的比例依次加入Beckman專用離心管中，4℃ 100 000 r/min超速離心60 min，取出承載exosomes的蔗糖/重水墊，用50倍體積的PBS稀釋，再經(jīng)100 000 r/min超速離心60 min，得到的沉淀即為exosomes。取適量PBS重懸，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80℃保存，備用。

1.4電子顯微鏡觀察exosomes形態(tài)及大小 取10 μl exosomes懸液滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20 g/L磷鎢酸溶液(pH 6.8)30 μl于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1 min，吸干負(fù)染液，在白熾燈下烤干，電子顯微鏡觀察。

1.5Western印跡分析CD81及MHC-Ⅰ類分子表達 以骨肉瘤細(xì)胞作為對照，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1011/L，-20℃快速凍融4次后，1 000 r/min離心30 min，取上清液，即為細(xì)胞裂解物。Exosomes經(jīng)超聲波沖擊破膜后，加入終濃度為2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)以去除脂蛋白的影響。取exosomes 40 μg及骨肉瘤細(xì)胞裂解物40 μg(對照)，分別加入適量電泳上樣緩沖液，沸水中加熱10 min，在12%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后用半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜1.5 h至醋酸纖維膜上；醋酸纖維膜用5%的脫脂奶粉包被2 h后，加入抗CD81抗體或抗MHC-Ⅰ類分子抗體，4℃過夜，PBS洗滌3次，10 min/次；然后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育30 min，PBST洗滌3次，15 min/次；最后加入ECL發(fā)光劑，暗室中曝光、顯影與定影。

2 結(jié) 果

2.1骨肉瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，見圖1。

2.2Exosomes的形態(tài)特征 對分離純化的exosomes懸浮液進行負(fù)染，電鏡下見骨肉瘤細(xì)胞來源的exosomes呈圓形或類圓形，大小相對均一，直徑約60～100 nm，散在分布或聚集成團，見圖2。

2.3Western印跡分析結(jié)果 分別用抗CD81或MHC-Ⅰ類分子的一抗孵育后，Western印跡分析結(jié)果顯示(圖3)，exosomes和細(xì)胞裂解物均表達CD81、MHC-Ⅰ類分子，骨肉瘤細(xì)胞來源exosomes兩類分子的灰度值均較腫瘤細(xì)胞裂解物高。

圖1 K7M2細(xì)胞形態(tài)(×100)

圖2 骨肉瘤細(xì)胞分泌的exosomes的電鏡照片

圖3 Exosomes的Western印跡分析結(jié)果

3 討 論

Exosomes由活細(xì)胞分泌，細(xì)胞在內(nèi)吞過程中形成多泡體(MVB)，MVB的膜向內(nèi)出芽、脫落后形成MVB內(nèi)小囊泡，當(dāng)MVB的質(zhì)膜與細(xì)胞膜融合，小囊泡以胞吐的形式被分泌到細(xì)胞外，即為exosomes〔4〕。Exosomes呈圓形或類圓形，直徑30～100 nm，密度1.13～1.21 g/ml。本研究采用梯度離心聯(lián)合密度屏障離心的方法從骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離提取exosomes，經(jīng)300 r/min離心去除上清液中的死細(xì)胞，800、10 000 r/min離心去除細(xì)胞碎片。為了縮短exosomes提取時間，將上清液放置于超濾離心管中過濾，使上清液中<100 ku的分子過濾掉，>100 ku的主要是exosomes(分子量為300～400 ku)則遺留在離心管內(nèi)，濃縮液經(jīng)30 g/L蔗糖/重水墊超速離心后exosomes則懸浮于蔗糖/重水墊中。通過透射電鏡觀察，見Texo成圓形或類圓形的，直徑約60～100 nm。

Exosome的蛋白組成目前還不十分清楚，通過Western印跡、流式細(xì)胞分析法、免疫熒光技術(shù)和質(zhì)譜分析等方法己明確了不同細(xì)胞來源的exosome含有一些共同的組成蛋白，主要有：①細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白等；②參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白；③各種代謝酶；④熱休克蛋白(Hsp)，如Hsp70和Hsp90；⑤四跨膜蛋白，CD9、CD63、CD81、CD82〔5〕。這些普遍存在的蛋白與抗原呈遞相關(guān)，可結(jié)合抗原多肽并攜帶至MHC分子。目前認(rèn)為exosome的標(biāo)志分子主要是MHC-Ⅰ類或Ⅱ類分子(對抗原呈遞細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞而言)、HSD和CD，這3類蛋白家族的成員也是目前最常用于鑒定exosome的分子標(biāo)志。MHC-Ⅰ類分子是重要的免疫分子，與腫瘤抗原結(jié)合后可激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。CD81為4次跨膜蛋白，在exosome中的作用目前還不清楚。CD81是普遍存在于細(xì)胞表面的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，常與其他免疫分子結(jié)合，可能參與了免疫細(xì)胞的活化。

腫瘤細(xì)胞來源的exosomes含有腫瘤相關(guān)抗原(如Mat1、gp 100、TRP和Her2/neu等)和免疫相關(guān)分子(MHC-Ⅰ類分子、CD81等)，被樹突細(xì)胞(DC)攝取后，可激活T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)〔6〕。Altieri等〔7〕用小鼠乳腺癌細(xì)胞系TS/A和肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞系P815提取exosomes，負(fù)載到骨髓細(xì)胞源的DC上，免疫荷瘤小鼠，見腫瘤生長緩慢。Bu等〔8〕從膠質(zhì)瘤患者腹水中提取的exosomes，負(fù)載到患者外周血來源的DC上，可刺激膠質(zhì)瘤患者產(chǎn)生特異性CD8+CTL應(yīng)答，抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長。Texo實際是一種抗原傳遞系統(tǒng)，能將腫瘤抗原轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細(xì)胞(APC)，從而激活CTL，Texo可作為腫瘤抗原的重要來源，啟動免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的保護性抗腫瘤反應(yīng)。Texo作為腫瘤疫苗已成為目前腫瘤免疫治療研究的熱點，但其在抗骨肉瘤免疫應(yīng)答中的研究尚未見報道。本研究從骨肉瘤細(xì)胞成功分離了exosome，為進一步進行免疫治療研究奠定了基礎(chǔ)。

4 參考文獻

1Wahlgren J, Karlson Tde L, Glader P,etal. Activated human T cells secrete exosomes that participate in IL-2 mediated immune response signaling 〔J〕. PLoS One, 2012;7(11):e49723.

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4金 錚，于金錄，楊 皊，等.膠質(zhì)瘤來源exosomes的鑒定及其蛋白質(zhì)組成研究〔J〕.中國實驗診斷學(xué), 2010;14(9): 1386-9.

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6Marton A, Vizler C, Kusz E,etal. Melanoma cell-derived exosomes alter macrophage and dendritic cell functions in vitro〔J〕. Immunol Lett, 2012;148(1): 34-8.

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8Bu N, Wu H, Sun B,etal. Exosome-loaded dendritic cells elicit tumor-specific CD8+cytotoxic T cells in patients with glioma〔J〕. J Neurooncol, 2011;104(3):659-67.