張 博 竇逾常 王垂杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032)

脾為人體正常生命活動提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，維持人體的內(nèi)外平衡，抵御外邪。脾胃不足，則氣血兩虛，可致病理性早衰。同時(shí)，衰老時(shí)所表現(xiàn)的精血不足與脾氣薄弱、運(yùn)化失司，后天乏源有很大關(guān)系。所以，脾氣健運(yùn)在祛病復(fù)健的同時(shí),又可收緩衰延年之功。脾虛可使機(jī)體抵御外邪功能下降，免疫功能降低等。腸道不但是食物消化吸收的場所，而且可能是發(fā)揮局部免疫效應(yīng)從而影響整體免疫的主要場所〔1〕。腸道黏膜免疫既是機(jī)體系統(tǒng)免疫的重要組成部分,同時(shí)又具有相對獨(dú)立性。很多研究發(fā)現(xiàn)，脾虛時(shí)胃腸黏膜分泌功能紊亂，免疫功能低下，因而胃腸道局部免疫狀態(tài)在脾虛證研究中十分重要。本實(shí)驗(yàn)擬探討脾虛老齡大鼠腸黏膜分泌性免疫球蛋白IgA (sIgA)、CD3、CD8細(xì)胞百分率，及四君子湯對其的影響。

1 材料和方法

1.1動物分組 SD雄性大鼠40只，21～22月齡，體重450～600 g (由遼寧中醫(yī)學(xué)院動物室提供)。分籠，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1 w后按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對照組、長期造模組、造?；謴?fù)組和四君子湯組。除正常對照組外，其余3組均制作大鼠長期脾虛模型。① 正常對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，生理鹽水4 ml/只灌胃，隔日1次，共7 w。②長期造模組大鼠予小承氣湯(1.5 ml/100 g)灌胃，當(dāng)日禁食不禁水，隔日1次，同時(shí)隔日足量喂食且游泳至耐力極限1次(以口鼻首次沒入水中為準(zhǔn))，共7 w。③造?；謴?fù)組前4 w喂養(yǎng)同長期造模組，4 w后改為常規(guī)飼養(yǎng)，共7 w。④四君子湯組前4 w同長期造模組；4 w后改為常規(guī)飼養(yǎng)，同時(shí)用四君子湯灌胃3 w，(1.5 ml/100 g),1次/d。于第10周末處死大鼠后取材處理。

1.2主要儀器與試劑 電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH·B11·500型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。微量移液器，美國熱電公司生產(chǎn)。酶標(biāo)儀，anthos2010型。流式細(xì)胞儀，BD FACSCalibur 。電子天平，JY5002型，0.01～500 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平，BS223S型，0.001～220 g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有統(tǒng)公司生產(chǎn)。ELISA酶免疫試劑盒,美國ADL公司。FITC Conjugated anti-rat CD3，PEConjugated anti-rat CD8， eBioscince，沈陽寶信科技有限公司提供。小承氣湯由厚樸、枳實(shí)、大黃(比例3∶3∶2)組成；四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草(比例2∶2∶2∶1)組成，均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，并由該院制劑室制成100%煎劑。

1.3測定方法

1.3.1sIgA測定 距幽門下 15 cm 處及回盲部腸組織5 cm，刮取小腸黏膜組織，經(jīng)溶解、離心后取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法檢測各組大鼠回腸黏膜中sIgA含量，嚴(yán)格按照試劑盒中說明書步驟進(jìn)行操作。于450 nm處檢測各孔吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)OD值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程，計(jì)算各檢測孔sIgA濃度。

1.3.2CD3、CD8細(xì)胞百分率測定 距回盲部5 cm處回腸組織約10 cm，沿中線剪開腸管，用載玻片刮取腸內(nèi)組織，300目銅網(wǎng)過濾，制成腸組織細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心10 min，去上清，加10 ml PBS混勻后過濾2次，加入3 ml淋巴細(xì)胞分離液，離心，取白色分層，預(yù)冷的PBS洗滌2次，懸浮至1 ml，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104～1×105，取1 ml細(xì)胞懸液，取專用試管4支，每管中加入細(xì)胞懸液100 μl，然后依次加入CD3-FITC、CD8-PE抗體及其同型對照抗體，充分混勻，室溫避光孵育30 min。1 500 r/ min，離心5 min，去上清。用2 ml PBS洗滌2次，加入PBS 0.5 ml懸起，4℃避 光1 h內(nèi) 在BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，Cell-quest 軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腸組織中sIgA 與空白對照組〔(68.52±12.71)ng/ml〕相比，脾虛各組腸組織中sIgA含量均有下降，其中四君子湯組sIgA含量〔(32.22±5.33)ng/ml〕高于造模恢復(fù)組〔(24.47±7.12)ng/ml〕，造?；謴?fù)組高于長期造模組〔(22.56±4.31)ng/ml〕(P<0.01或P< 0.05)。

2.2各組大鼠腸組織中CD3、CD8細(xì)胞百分率 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中CD3、CD8細(xì)胞百率均下降，其中四君子湯組CD3、CD8細(xì)胞百分率高于造?；謴?fù)組，造模恢復(fù)組高于長期造模組(P<0.01)。 見表1。

表1 各組大鼠腸組織中CD3、CD8細(xì)胞百分率

3 討 論

腸黏膜免疫系統(tǒng)由彌漫分布于腸黏膜上皮內(nèi)和固有層的免疫細(xì)胞、免疫分子及潘氏結(jié)(PP結(jié))等腸黏膜相關(guān)性淋巴組織(GALT)組成。功能上分為B、T淋巴細(xì)胞, 分別具有體液免疫和細(xì)胞免疫的作用,產(chǎn)生免疫應(yīng)答〔2〕，參與構(gòu)成機(jī)體抵抗外界入侵的第一道防線,在腸道免疫功能的調(diào)節(jié)過程中起重要作用。腸黏膜內(nèi)T淋巴細(xì)胞可以發(fā)揮細(xì)胞毒作用以保護(hù)腸隱凹干細(xì)胞分化出的新生上皮細(xì)胞，使其順利完成向腸絨毛頂部遷移過程，從而維持腸上皮細(xì)胞的完整性，同時(shí)它也向B細(xì)胞、漿細(xì)胞傳遞活化信息；而漿細(xì)胞是已活化的B細(xì)胞，它能分泌 IgA 并以 sIgA的形式進(jìn)入腸腔中與腸腔內(nèi)的病菌結(jié)合，使其能黏附到腸黏膜上從而阻止其位移，或直接中和其毒性。T細(xì)胞和B細(xì)胞對于維持腸黏膜的完整性、順利發(fā)揮其屏障作用具有重要的意義。

sIgA和CD3分布和數(shù)量可以反映腸黏膜局部的細(xì)胞免疫及體液免疫功能。CD3是所有T細(xì)胞的共同標(biāo)志，CD3作為T細(xì)胞抗原受體, 為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位, 能將TCR接受的抗原刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi), 使T細(xì)胞活化, 在T細(xì)胞免疫中起著必不可少的作用〔3〕。CD3+T淋巴細(xì)胞可以抑制 TLR途徑激活的固有免疫反應(yīng)，防止促炎癥細(xì)胞因子作用，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生〔4，5〕。CD8淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,參與抗病毒、移植排斥反應(yīng)及對非己抗原誘發(fā)的免疫應(yīng)答的抑制，其數(shù)量的增多或減少可間接反映人體的免疫功能〔6，7〕。slgA進(jìn)入腸道能選擇性地包被革蘭陰性菌,形成抗原抗體復(fù)合物,阻礙細(xì)菌與上皮細(xì)胞受體相結(jié)合,同時(shí)刺激腸道黏液分泌并加速黏液層的流動,可有效地阻止細(xì)菌對腸黏膜的粘附。此外,slgA還可以中和腸道病毒,具有中和毒素、溶解細(xì)菌及免疫排除等作用。

4 參考文獻(xiàn)

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2任宏宇, 鄒開芳. 炎癥性腸病腸黏膜組織內(nèi)淋巴細(xì)胞激活和效應(yīng)應(yīng)答〔J〕.世界華人消化雜志,2008;16:3178-80.

3張有聰, 劉淑英. T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的研究進(jìn)展〔J〕.畜牧與飼料科學(xué),2006;27:75-8.

4Kim KD, Zhao J, Auh S,etal. Adaptive immune cells temper initial innate responses〔J〕. Nat Med, 2007; 13(10):1248-52.

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7Dace DS, Chen PW, Niederkorn JY. CD8+T cells circumvent immune privilege in the eye and mediate intraocular tumor rejection by a TNF-alpha dependent mechanism〔J〕.J Immunol,2007;178:6115-22.