馬俊驥 趙 慧 姜慧卿

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科 河北省消化病實驗室 河北省消化病研究所，河北 石家莊 050000)

肝纖維化慢性肝損傷發(fā)展為肝硬化的共同病理改變，表現(xiàn)為肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)的過度合成與異常沉積〔1〕。肝星狀細胞(HSC)是慢性肝損傷后合成ECM并參與纖維化進程最主要的細胞成分，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)〔2, 3〕。前期的研究發(fā)現(xiàn)，Raf激酶抑制蛋白(RKIP)在肝臟纖維化組織表達下降，HSC活化后RKIP表達降低，RKIP過表達可以促進HSC遷移〔4, 5〕。RKIP低表達與HSC在細胞外基質(zhì)上黏附的關(guān)系目前尚不清楚。本研究采用siRNA靶向介導(dǎo)RKIP基因，研究RKIP低表達對HSC在細胞外基質(zhì)上黏附的影響。

1 材料和方法

1.1材料 HSC細胞株人LX-2經(jīng)美國Friedman教授授權(quán)由美國Mount Sinai醫(yī)科大學(xué)惠贈。RKIP-RNAi-AD為靶向RKIP基因并表達綠色熒光蛋白 (GFP)的重組腺病毒載體，攜帶的靶向序列為5′-CGAGCAGCTGTCTGGGAAGTA-3′，NC-RNAi-GFP-AD為僅表達GFP的腺病毒對照。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和病毒感染分組 將保存于液氮中的LX-2細胞株取出，立即37℃水浴復(fù)蘇，于超凈工作臺中加2 ml的DMEM培養(yǎng)基，1 200 r/min離心5 min，以10% FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L谷氨酰胺及1 mol/L HEPES的DMEM培養(yǎng)基稀釋成1×106/ml的濃度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當生長至致密單層時，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶4傳代，24 h換液1次，72 h再次培養(yǎng)傳代。病毒感染HSC的分組: RKIP-RNAi-AD組，在HSC內(nèi)靶向敲除RKIP基因并表達GFP基因；NC-RNAi-GFP-AD對照組，在HSC內(nèi)表達外源GFP基因。將LX-2細胞以每孔3 000個接種于96孔板中，但細胞生長至90%左右時，RKIP-RNAi-AD重組腺病毒或者NC-RNAi-GFP-AD腺病毒按MOI值分別為5、10、15、20干預(yù)細胞，每種MOI設(shè)10個復(fù)孔，分別于12、24、48 h于熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，并計數(shù)熒光數(shù)。

1.2.2Western 印跡 取腺病毒干預(yù)的LX-2細胞，棄去上清，冰冷的PBS漂洗兩遍，加入1 ml PBS液，細胞刮刀將細胞刮下，移入Eppendorf管中，4℃ 3 000 r/min離心10 min。棄上清，加入150 μl改良的RIPA裂解緩沖液，微型混合器上充分振蕩，冰上靜置裂解30 min，4 ℃10 000 r/min離心10 min，取上清用Braford法測總蛋白含量。按每孔80 μg計算樣品的上樣量，將蛋白樣品與上樣緩沖液以4∶1的比例混勻，煮沸5 min加在上樣孔中，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠的濃度為12%。用0.22 μm PVDF膜進行冰浴轉(zhuǎn)膜，取出膜用5%脫脂奶粉在室溫下封閉4 h。4 ℃下一抗封閉過夜。二抗室溫封閉2 h。在暗室中滴加ECL試劑反應(yīng)3 min，曝光、顯影和定影。顯影條帶經(jīng)香港基因公司G∶BOX凝膠成像分析儀采集后，用美國NIH ImageJ 1.38軟件進行定量分析。RKIP以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參照的光密度百分比來表示。

1.2.3黏附試驗 (1) matrigel的配制：用DMEM (無Ca2+、Mg2+)稀釋為50 μg/ml備用。(2) I型膠原的配制：用無菌10×PBS、dH2O和1N NaOH稀釋成50 μg/ml。(3) 纖維連接蛋白：用DMEM (Ca2+、Mg2+)稀釋為50 μg/ml備用。(4) 包被孔板：在超凈工作臺上，取配置好的基質(zhì)膠以200 μl/孔均勻平鋪于24板內(nèi)，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于4℃冰箱中過夜。之后用無菌PBS洗去多余的基質(zhì)膠，每孔加入0.5% BSA 200 μl室溫孵育30 min，無菌PBS漂洗3遍備用。(5) 將RKIP-RNAi-AD腺病毒或者NC-RNAi-GFP-AD腺病毒感染的細胞從培養(yǎng)箱中取出，棄上清，以0.25%胰蛋白酶消化至細胞松散后，棄去消化液，加入3 ml 0%DMEM培養(yǎng)基，制成單細胞懸液計數(shù)后稀釋成1×105/ml的濃度。將細胞懸液接種在包被好的24孔板內(nèi)，每孔接種1 ml，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后取出培養(yǎng)板，吸去上清，無菌PBS洗去未黏附的細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗后，結(jié)晶紫染色15 min，在200倍顯微鏡下隨機選取12個不同視野計數(shù)細胞數(shù)，并采集圖片。

2 結(jié) 果

2.1SiRNA靶向敲除RKIP基因后Western 印跡鑒定結(jié)果 選擇MOI值為5的RKIP-RNAi-AD感染LX-2后48 h，熒光顯微鏡下觀察含熒光的細胞數(shù)，計算細胞感染率80%～90%。與NC-RNAi-GFP-AD組相比，RKIP-RNAi-AD組目的蛋白RKIP表達明顯下降(0.29±0.06 vs 0.73±0.14，P<0.05)。 見圖1。

2.2RKIP減少致HSC在matrigel上的黏附增多 RKIP-RNAi-AD組和對照NC-RNAi-GFP-AD組相比，在matrigel上黏附的LX-2細胞數(shù)明顯增多(170±25 vs 66±12，P<0.05)。見圖2。

2.3RKIP減少致HSC在I型膠原上的黏附增多 與NC-RNAi-GFP-AD組相比，RKIP-RNAi-AD感染的LX-2細胞在I型膠原上黏附的細胞數(shù)明顯增多(200±25 vs 82±13，P<0.05)。見圖3。

2.4RKIP減少致HSC在纖維連接蛋白上的黏附增多 與NC-RNAi-GFP-AD組相比，RKIP-RNAi-AD感染的LX-2細胞在纖維連接蛋白上黏附的細胞數(shù)明顯增多(276±28 vs 96±17，P<0.05)。見圖4。

圖1 RKIP的RNAi腺病毒感染HSC后的Western 印跡結(jié)果

圖2 HSC與matrigel基質(zhì)膠的黏附

圖3 HSC與I型膠原的黏附

圖4 HSC與纖維連接蛋白的黏附

3 討 論

病毒、酒精、糖尿病、肥胖、免疫性疾病、藥物和膽汁淤積等損傷都能對肝臟產(chǎn)生慢性刺激，導(dǎo)致肝臟不斷地再生進而引起實質(zhì)結(jié)構(gòu)和血管構(gòu)成(門脈系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng))的紊亂，最后可以形成肝結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)即肝硬化，血管構(gòu)成紊亂可以導(dǎo)致門脈高壓的形成〔6〕。如果肝臟維持正常承載量，則肝硬化患者能夠保證一段時間正常肝功能(代償期)；但在很多時候肝臟功能最終出現(xiàn)失代償，甚至需要肝臟移植才能維持生存。因此，肝纖維化作為各種慢性肝病進展過程中一個共同的病理環(huán)節(jié)，深入研究其發(fā)生機制至關(guān)重要。

我們前期利用膽總管結(jié)扎的肝纖維化動物模型發(fā)現(xiàn)RKIP在肝臟纖維化組織表達下降，同時伴隨Raf/MEK/ERK信號通路活化〔4〕。原代HSC的體外培養(yǎng)證實隨著HSC在體外活化，RKIP的表達也明顯降低，進一步研究證實RKIP抑制HSC細胞增殖，但卻促進其遷移，用RKIP抑制劑Locostatin可以抑制HSC遷移〔5〕。HSC在正常肝臟占肝臟細胞數(shù)量的5%～10%，定居在Disse間隙，病理因素刺激后HSC活化可以遷移黏附在受損傷的組織，參與損傷修復(fù)。長期的慢性刺激可以導(dǎo)致HSC過度活化并伴隨ECM過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和門脈高壓的產(chǎn)生。

ECM主要包括膠原、非膠原糖蛋白和蛋白多糖。肝纖維化的病理改變即是肝臟內(nèi)ECM異常沉積〔7〕。在肝纖維化形成過程中，膠原成分中最密切的是I型的沉積，隨著肝纖維化的發(fā)生，I型膠原從基因表達和蛋白水平上都明顯增加〔8〕。已發(fā)現(xiàn)非膠原糖蛋白如纖維連接蛋白、層黏連蛋白、腱生蛋白、分層蛋白、巢蛋白和透明質(zhì)酸表達增加。肝竇狀腺內(nèi)皮細胞和HSCs擁有共同的胚胎起源，由肝竇狀腺內(nèi)皮細胞生成的纖維連接蛋白薄片早期變化能夠激活HSCs〔9〕。一些蛋白多糖成分如肝素、皮膚素、硫酸軟骨素、基底膜蛋白多糖、核心蛋白多糖等也過度沉積。

本研究結(jié)果顯示RKIP低表達可以明顯增加HSC在細胞外基質(zhì)matrigel基質(zhì)膠上黏附的細胞數(shù)，同時也可以增加HSC在Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白上的黏附。反映了在病理狀態(tài)下RKIP在HSC中的降低與其黏附功能的改變密切相關(guān)，這可以保證HSC對損傷肝臟的修復(fù)，但同時會導(dǎo)致肝臟纖維過程的進展。RKIP低表達與肝纖維化的關(guān)系可能是其促進了HSC在I型膠原和纖維連接蛋白上的黏附，進而增加HSC在ECM上的黏附。結(jié)合前期的研究也有可能是因為RKIP低表達更促進了Raf-1/MEK/ERK1和NF-κB等信號通路的活化。RKIP的分子量為23 kDa，具有與磷脂酰乙醇胺結(jié)合的特性，RKIP可以干擾Raf-1的激活，進而負向調(diào)節(jié)Raf/MEK/ERK信號通路，還可以通過G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的信號通路及NF-κB信號通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用〔5～10〕。

綜上所述，在肝纖維化形成過程中，HSC活化后RKIP表達下降可以促進HSC在細胞外基質(zhì)上的黏附功能，此與肝臟組織的修復(fù)功能有關(guān)，但卻加重了肝纖維化的進程。

4 參考文獻

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