楊崇哲 劉 豐 銀孟卓 潘朝慶 張韶岡

(廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東 廣州 510180)

microRNAs參與細(xì)胞凋亡、增殖及分化、個體分化、脂肪代謝、激素分泌等細(xì)胞周期及生理過程，其獨特的生理功能使其與各種疾病關(guān)系的研究成為研究熱點〔1～4〕。隨著人們生活水平的不斷提高，我國糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率呈顯著升高趨勢。但DM的發(fā)病機制尚未完全闡明，在預(yù)防和治療方面也仍不完善〔5，6〕。T2DM是一種多病因的代謝性疾病，與基因異常等多種因素相關(guān)。而目前對其大量研究工作僅集中于T2DM編碼蛋白的易感基因篩查和功能的鑒定，關(guān)于microRNA異常與其發(fā)病的關(guān)系知之甚少。過氧化物酶體增殖物激活受體gamma(PPARγ)作為治療DM重要藥物的靶點，是在DM分子機制中起重要作用的核受體和轉(zhuǎn)錄因子。本實驗首次應(yīng)用實驗DM大鼠進行microRNA、PPARγ及其于DM相關(guān)性檢測，以探討microRNA在T2DM發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1試劑及設(shè)備 鏈脲佐菌素(STZ，美國sigma公司)；one touchⅡ血糖儀(美國強生公司)；DNA DNase I(fermentas公司)；Taqman microRNA試劑盒 (ABI公司)；LightShiftTM Chemiluminescent EMSA試劑盒(Pierce，美國)；核蛋白提取試劑盒(Pierce，美國)

1.2方法

1.2.1實驗動物 動物分組與模型制備：雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，購于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。隨機分為對照組，DM 1 w組，DM 1個月組，每組大鼠10只。擬為DM模型組大鼠空腹12 h后按50 mg/kg腹腔一次性注射新配制STZ，72 h后大鼠尾靜脈采血測血糖，空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L者作為大鼠DM模型建立標(biāo)準(zhǔn)。對照組大鼠腹腔注射等劑量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。實驗期間，所有大鼠分籠飼養(yǎng)，置于溫度(20±2)℃，濕度 55%～65%，每天12 h日光照維持，均常規(guī)飼料喂養(yǎng)、自由飲水。分別于造模后相應(yīng)時間以鹽酸氯胺酮(2%，1 ml/100 g)麻醉后處死大鼠并分離大鼠股四頭肌，組織立即置于-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2全RNA提取 準(zhǔn)備：提取過程中所用的EP管、槍頭、容器等均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡12 h后高壓消毒。提取時需要佩戴口罩、帽子、手套，謹(jǐn)防RNA酶污染。取組織約100 mg，加入RNA提取液(TRIzol)1 ml研磨組織使其裂解，溶解于TRIZOL中，收集懸液于1.5 ml EP管中，加入200 ml氯仿，上下顛倒搖勻30 s，室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，可見液體分為三層，將上層移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒搖勻30 s，室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入75%酒精漂洗。4℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清，將液體吸干，沉淀干燥，20 μl DEPC處理過的水溶解RNA。DNase I處理除去基因組 RNA含量及純度測定采用分光光度測定法：OD260/OD280約為2.0，OD260/OD230約為1.4。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 以Taqman microRNA試劑盒及TAKARA 將所提取RNA逆轉(zhuǎn)錄至cDNA后進行 qPCR 反應(yīng)。溫度設(shè)置為：起始模板變性95℃10 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40個循環(huán)。每例樣本均經(jīng)三孔重復(fù)。microRNA27b，130(miR27b，130)以microRNA RNU6作為內(nèi)部參照，PPARγ以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部參照。計算機分析獲得樣本及內(nèi)參的Ct值。mRNA相對值=2-ΔΔCT。

1.2.4核蛋白提取及電泳遷移率實驗(EM-SA) 取組織約100 mg，使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，實驗步驟按試劑盒說明書進行。以二喹啉甲酸(BCA)法檢測上清液中核蛋白濃度，核蛋白于-80℃保存待用。

使用LightShiftTM Chemiluminescent EMSA試劑盒進行凝膠遷移實驗，檢測PPAR結(jié)合能力檢測。抽提核蛋白步驟，TRBP探針由上海生物工程生物制品有限公司合成、純化，序列為5′-CGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCC-3′，并在5 端標(biāo)記生物素。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1大鼠體重、血糖的變化 DM各組大鼠的FPG均在≥16.7 mmol/L。與對照組相比，1 w時DM組大鼠血糖顯著增高，1個月時DM組大鼠體重、血糖差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠體重、血糖的變化

2.2miR27b、miR130、PPARγ在大鼠骨骼肌的表達 與對照組相比，DM組大鼠骨骼肌中miR20b的RNA水平表達明顯增加(P<0.01)，miR130的RNA水平表達顯著降低(P<0.01)；同時PPARγ的mRNA顯著降低(P<0.01)，且隨著時間延長增加趨勢越明顯。見圖1。

與對照組比較：1)P<0.05

2.3大鼠骨骼肌中PPAR結(jié)合能力改變 EM-SA電泳條帶灰度分析,與對照組相比，糖尿病組大鼠骨骼肌中PPAR的DNA結(jié)合能力也顯著降低(P<0.01)，且隨著時間延長增加趨勢越明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠骨骼肌中PPAR結(jié)合能力

2.4DM組大鼠血糖與miR27b及miR130相關(guān)性研究 以于對照組相比，miR27b、miR130在大鼠骨骼肌的相對RNA表達水平同大鼠血糖水平進行相關(guān)性分析。DM組大鼠血糖水平與miR27b的RNA水平存在負(fù)相關(guān)(R=-0.918，P<0.01)，與miR130存在正相關(guān)(R=0.833，P<0.01)。見圖3，圖4。

圖3 DM組大鼠血糖與miR27b相關(guān)性研究

圖4 DM組大鼠血糖與miR130相關(guān)性研究

3 討 論

PPARγ屬于核受體超家族，是包括PPARα和PPARβ/δ在內(nèi)的NR1C亞類中的成員之一〔7〕。NR1C亞類中的這些受體與維甲酸類X受體(RXR)形成異二聚體，結(jié)合于特異的DNA序列而使靶基因激活從而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ活化后可能影響到其他組織，PPARγ的選擇性配體不僅能有效降低如骨骼肌的葡萄糖利用，還可調(diào)節(jié)由脂肪組織分泌的一些特殊信號分子，如腫瘤壞死性因子(TNF-α)、瘦素(Leptin)等，這些產(chǎn)物反過來又可調(diào)節(jié)其他組織的糖代謝〔8〕。本研提示在DM大鼠1 w時活性就明顯降低，且隨著病程的延長、血糖增高加重而持續(xù)，也證實了PPARγ 參與了血糖調(diào)節(jié)紊亂的發(fā)生和發(fā)展。

研究表明一個microRNA家族可能結(jié)合至多達200個靶基因，而microRNA可能調(diào)控約30%的基因，從而參與多種病理和生理過程。PPARγ受多種microRNA調(diào)節(jié)，miR27b、miR130可通過影響PPARγ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪細(xì)胞生成分化〔9〕。本研究提示miR27b、miR130可能通過調(diào)節(jié)PPARγ參與DM過程中血糖調(diào)節(jié)作用。

T2DM過程中，microRNA表達增加，伴隨明顯PPARγ抑制能明顯促進其他靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究揭示了microRNA參與PPARγ轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)的新機制。與此一致的是，由于RXR同樣在PPARγ的轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)揮了重要作用，microRNA對RXR與PPARγ相互作用的影響機制有待進一步研究。

綜上，microRNA 可通過調(diào)節(jié)PPARγ參與DM的發(fā)生、發(fā)展，并且隨著對microRNA調(diào)控基因表達的研究逐步深入，這種調(diào)控機制將在DM預(yù)防及治療中發(fā)揮重要作用，也幫助我們理解高等真核生物的基因組繁雜的功能及復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 參考文獻

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