齊亞靈 王偉群 張建華 趙曉蓮 張 坤 于海波 賈秀月 齊淑芳 邵明亮

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

前列腺癌發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美國(guó)家，前列腺癌的發(fā)病率最高，并且其病死率也僅次于肺癌，位于第二位。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率每年以10%的速度快速增加。腫瘤的分子病理學(xué)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，多種生物分子都參與其發(fā)生與演進(jìn)過程，目前眾多的研究已經(jīng)證實(shí)趨化因子及其受體在腫瘤的眾多生物學(xué)中扮演著重要角色〔1〕。趨化因子是一類能使細(xì)胞發(fā)生趨化作用的細(xì)胞因子，其可通過趨化因子受體廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理功能，并在多種病理過程中如腫瘤的生長(zhǎng)、存活、遷移、血管發(fā)生、白細(xì)胞浸潤(rùn)等發(fā)揮重要作用。本研究探討CXC趨化因子配體(CXCL)5受體(CXCR2)在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)及CXCL5對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑及儀器 PC-3、DU145及LNCaP細(xì)胞(美國(guó)ATCC)；RPMI1640 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所公司)；重組人CXCL5(美國(guó)PeproTech公司)；鼠抗人β-actin抗體、兔抗人CXCR2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；青、鏈霉素、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、ECL顯影液(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司)；EPS100 、EPS300電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.2Western印跡檢測(cè)CXCL5 受體CXCR2在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá) PC-3、DU145及LNCaP前列腺癌細(xì)胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)基中(血清含量及雙抗?jié)舛确謩e為10%和100 U/ml )，并培養(yǎng)于CO2濃度為5%的37℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA方法測(cè)定各細(xì)胞株蛋白濃度。將30 μg總蛋白于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(270 mA 1 h)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h； PBST洗膜5 min×3次；鼠抗人β-actin(1∶500)抗體或兔抗人CXCR2抗體(1∶200)4℃孵育過夜；PBST洗膜10 min×3次；山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶4 000)或山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜15 min×3次；ECL顯影液孵育膜2～3 min后置于暗盒中曝光，調(diào)整曝光時(shí)間并進(jìn)行顯影和定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以PC-3細(xì)胞β-actin條帶的灰度值為1，計(jì)算各條帶灰度值。各細(xì)胞株CXCR2與其內(nèi)參actin灰度值之比代表各細(xì)胞株CXCR2蛋白的相對(duì)含量。

1.3MTT法檢測(cè)重組人CXCL5對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響 重組人CXCL5用0.1%BSA溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，凍存于-80℃冰箱中備用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的LNCaP細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基(血清含量及雙抗?jié)舛确謩e為5%和100 U/ml)接種于96孔板中，1.5×103個(gè)/孔。次日，將96孔板中的細(xì)胞分為4組(對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組)，每組6孔。對(duì)照組用上述培養(yǎng)基+0.1%BSA培養(yǎng)(CXCL5終濃度為0 ng/ml)；實(shí)驗(yàn)組用上述培養(yǎng)基+CXCL5培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組CXCL5終濃度分別為5，10，20 ng/ml)。從加入CXCL5后培養(yǎng)至第3天，各組細(xì)胞換各自的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至第6天用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CXCR2蛋白在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 CXCR2在DU145和LNCaP細(xì)胞中表達(dá)量較高，而在PC-3細(xì)胞中其表達(dá)量則較低，PC-3、DU145和LNCaP細(xì)胞目的基因蛋白CXCR2與內(nèi)參actin灰度值之比分別為0.36±0.056，1.44±0.107，1.65±0.089(P<0.05)(圖1)。

圖1 CXCR2蛋白在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)

2.2重組人CXCL5促進(jìn)LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng) 對(duì)照組及5、10、20 ng/ml組細(xì)胞的吸光度值分別為0.52±0.14，0.55±0.06，0.61±0.08和0.73±0.10。與對(duì)照組比較，20 ng/ml組增長(zhǎng)率明顯增高(P<0.05)，這說明CXCL5可以明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞LNCaP的增殖。

3 討 論

趨化因子是一類可介導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞激活、細(xì)胞分化和血管發(fā)生等多種功能的小分子物質(zhì)。按多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，趨化因子可分為CXC、CC、C和CX3C等四個(gè)亞家族(C為半胱氨酸，X為任意氨基酸)。其中，靠近N端兩個(gè)半胱氨酸(Cys)之間插有任意一個(gè)氨基酸的被稱為CXC亞家族，同理，插有任意3個(gè)氨基酸的被稱為CX3C亞家族。目前CXC家族已發(fā)現(xiàn)16個(gè)成員，按其結(jié)構(gòu)功能區(qū)第一個(gè)半胱氨酸前是否存在ELR結(jié)構(gòu)(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，Glu-Leu-Arg)，進(jìn)一步將其分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。目前認(rèn)為ELR+CXC 類趨化因子(如CXCL1、CXCL3和CXCL5等)可以通過表達(dá)于癌上皮細(xì)胞上的CXCR2受體而促進(jìn)其增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并介導(dǎo)血管發(fā)生〔2～4〕。而ELR-CXC 趨化因子如CXCL4、CXCL9和CXCL10則可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的趨向性，從而抑制血管發(fā)生。有報(bào)道〔5〕表明，胰腺癌中CXCL5可通過激活A(yù)kt、ERK和STAT等信號(hào)通路而介導(dǎo)血管發(fā)生，并且CXCL5過表達(dá)與胰腺癌的低分化、高分期以及短期存活率密切相關(guān)。這與之前研究〔6〕的CXCL5在前列腺癌組織的表達(dá)率明顯高于前列腺增生組織的結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與其他惡性腫瘤的研究結(jié)果相似，外源性重組CXCL5可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長(zhǎng)。之所以選擇LNCaP做生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，這是因?yàn)橄鄬?duì)于其他兩株前列腺癌細(xì)胞(PC-3和DU145)，CXCR2在LNCaP細(xì)胞株的表達(dá)量相對(duì)較多，因此，外源性CXCL5對(duì)其作用可能會(huì)更加明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了先前提出的假設(shè)，即癌間質(zhì)表達(dá)的CXCL5以及癌上表達(dá)的CXCL5可分別通過旁分泌和自分泌作用于癌上皮的CXCR2受體而參與前列腺癌的發(fā)展與演進(jìn)過程〔6〕；為進(jìn)一步建立過表達(dá)CXCL5的前列腺間質(zhì)細(xì)胞和癌上皮細(xì)胞細(xì)胞株，開展CXCL5旁分泌和自分泌機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

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