張 偉 任鳳云 金 丹 潘艷明 胡 靜 馮玉寬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度決定了肺癌患者的預(yù)后和治療手段的選擇。近來，由于淋巴管的特異性標(biāo)志物如淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(LYVE)-1,相關(guān)基因prox-1,足細(xì)胞表面蛋白podoplanin和單克隆抗體D2-40等的發(fā)現(xiàn)，使研究腫瘤新生淋巴管的臨床和病理學(xué)意義成為可能，也使腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逐漸成為研究熱點。目前普遍認(rèn)為，在一些腫瘤中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C和VEGF-D調(diào)控著淋巴管的生成，二者可以激活其受體VEGFR-3而誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成和促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。然而，已往多集中于VEGF-C的研究，并且這些研究表明非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織VEGF-C的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，抑制VEGF-C表達(dá)可明顯降低淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而有關(guān)VEGF-D在NSCLC的表達(dá)及其臨床意義的報道較少。本文擬探討NSCLC組織VEGF-D的表達(dá)及微淋巴管密度(LMVD)與包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在內(nèi)的病理學(xué)參數(shù)間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 選自2007年9月至2008 年6月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和附屬第三醫(yī)院確診為NSCLC患者的手術(shù)切除組織。其中腺癌58例，鱗狀細(xì)胞癌38例。樣本取自手術(shù)切除的肺葉組織，標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,4 μm 厚連續(xù)切片,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE) 染色，其中60例新鮮組織置于液氮中速凍，儲存于-80℃低溫冰箱中直至RNA抽提。兔抗人VEGF-D多克隆抗體和鼠抗人D2-40單克隆抗體購自Santa Cruz公司。PV-9000免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實時定量(QRT)-PCR檢測試劑均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.2免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色方法參照PV29000 兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,HE復(fù)染,中性樹脂封片,光鏡觀察。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，參照以往研究的判定標(biāo)準(zhǔn),以每張切片中看到>30%的腫瘤細(xì)胞質(zhì)染色陽性判定為VEGF-D陽性。參照Weidner的判定標(biāo)準(zhǔn),在低倍鏡下，選取D2-40陽性脈管最豐富的區(qū)域,然后在200 倍視野范圍計算5個視野的淋巴管數(shù)目,取其平均值作為LMVD。

1.3RT-PCR

1.3.1總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將肺癌組織從液氮中取出,研磨成粉末,轉(zhuǎn)入焦炭酸二乙酯(DEPC)水處理過的1.5 ml微量離心管(EP)管中,按比例加入總RNA 提取液RNAiso reagent (TaKaRa Code.D312,大連)，按說明書提取肺癌組織總RNA ,-70℃保存待用。取適量稀釋后測定A260 和A280 時的吸光度比值,計算RNA 的濃度。另取5 μl RNA 溶液用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察RNA 的完整性。取總RNA 1 μg ，以O(shè)ligo dT 和 Random 6 mers (TaKaRa,大連)為引物,使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa Code.DRR014A,大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存待用。

1.3.2引物設(shè)計與合成 在GenBank上查找人VEGF-D基因的mRNA 序列,取其保守區(qū),使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。VEGF-D基因的引物序列為：正義5′-CCGTGAAAATGCTGAAAGAGG -3′，反義5′-GTTGCCGATGTGAATGAGGA-3′；GAPDH基因的引物序列為：正義5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 隨機(jī)取兩樣本的cDNA作為模板,應(yīng)用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大連)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增曲線和融解曲線，鑒定引物的特異性。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取樣品總RNA(500 ng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，應(yīng)用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大連)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增曲線的Ct值，取目的基因表達(dá)量豐富的樣品cDNA用EASY Dilution分別按8倍梯度稀釋(80、81、82、83、84倍)，以作為管家基因(GAPDH)和目的基因(VEGF-D)的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，分別制作管家基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。RT反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μl,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 10.5 μl,Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl ，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl， Total RNA 2 μl ，RNase Free dH2O 4.5 μl，反應(yīng)條件為：37℃15 min 85℃5 s ；PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μl ,正義、反義引物(10 μmol/L) 0.5 μl 、RT產(chǎn)物2 μl、dH2O 10～25 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 s;95℃ 5 s ,60℃ 30 s，45個循環(huán)。

1.3.4VEGF-D mRNA熒光定量PCR檢測 取各樣本cDNA 與相應(yīng)的引物按照以上條件混合,同上條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將目的基因的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較計算目的基因的濃度。為消除RNA 降解的影響,以目的基因VEGF-D與內(nèi)參照(GAPDH) 的比值表示目的基因的相對含量。每個樣本重復(fù)3 次，以均值來表示結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1VEGF-D 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組化染色顯示VEGF-D主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)(圖1A),在癌侵犯邊緣的血管和淋巴管的內(nèi)皮也可見VEGF-D的陽性表達(dá)(圖1B),并且在癌的基質(zhì)部分和成纖維細(xì)胞亦可見VEGF-D的陽性表達(dá)(圖1C)。在96例NSCLC組織中,VEGF-D 在侵犯邊緣的陽性率明顯高于癌中央組織的表達(dá),呈現(xiàn)染色不均一性(41.7% vs 24.0%,P=0.009)。

A B C

2.2VEGF-D 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 在癌侵犯邊緣區(qū)， VEGF-D高表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管侵犯的發(fā)生明顯高于低表達(dá)組(P=0.019,P=0.025)。然而在癌中央?yún)^(qū)卻未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。見表1。

2.3VEGF-D mRNA在NSCLC組織的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性 癌中心組織、癌侵犯邊緣組織和癌周圍肺組織表達(dá)量差異明顯。癌中央組織VEGF-D基因的表達(dá)量明顯低于癌周圍肺組織(0.193±0.154 vs 3.542±1.513,P<0.001)，VEGF-D mRNA的表達(dá)量在癌侵犯邊緣組織亦高于癌周肺組織 (4.309±2.075 vs 3.542±1.513,P=0.022)。

表1 NSCLC組織VEGF-D蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性〔n(%)〕

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中央部位的VEGF-D mRNA表達(dá)低于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，而在邊緣部位卻又截然相反。對于邊緣部位，VEGF-D mRNA的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或淋巴管侵犯具有相關(guān)性(P=0.007,P=0.033)。見表2。

2.4VEGF-D表達(dá)與LMVD的相關(guān)性 腫瘤組織中，癌邊緣部位LMVD明顯高于癌中央?yún)^(qū)(19.01±7.55 vs 15.15±5.72，P<0.001)，有淋巴管侵犯的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.37±7.93 vs 17.48±6.27,P=0.009)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.28±7.89 vs 17.81±6.90，P=0.024)。見圖2。

把LMVD高于平均密度的腫瘤組定義為高淋巴管密度組，反之定義為低淋巴管密度組。在癌侵犯邊緣區(qū),高淋巴管密度的VEGF-D mRNA表達(dá)明顯高于低淋巴管密度組(P=0.020)。而在癌中央?yún)^(qū)這種相關(guān)性未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.541)。

圖2 淋巴管的免疫組化染色及淋巴管密度與淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

表2 NSCLC組織VEGF-D mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤血管生成與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但大部分惡性腫瘤特別是上皮來源的惡性腫瘤早期以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，因此，區(qū)域引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況是評估預(yù)后和制定治療策略的重要生物學(xué)指標(biāo)。目前認(rèn)為除少數(shù)的惡性腫瘤(如肝癌、小細(xì)胞肺癌)之外，大多數(shù)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移早于血道轉(zhuǎn)移。

NSCLC在腫瘤早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移程度是決定患者臨床病理分期和臨床治療的重要因素之一。前期關(guān)于NSCLC巴管生成的研究多局限于VEGF-C和其受體(VEGFR-3)的研究。然而，以往的這些研究在有關(guān)VEGF-C是否影響NSCLC預(yù)后這一問題上始終未取得一致的結(jié)論〔1～5〕，因此VEGF-C表達(dá)與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍然備受關(guān)注〔6,7〕。VEGF-D是VEGF家族中的另一成員，研究〔8〕顯示可以誘導(dǎo)鼠腫瘤模型淋巴管生成和促使腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移。但是很少有文獻(xiàn)報道VEGF-D在NSCLC中的表達(dá)意義，因此在NSCLC中的VEGF-D表達(dá)與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系人們知之甚少。

Arinaga〔3〕,Ogawa〔5〕和Renyi-Vamos〔1〕等應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法報道VEGF-C表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生沒有明顯的相關(guān)性，而Kajita等〔2〕表達(dá)二者明顯相關(guān)。Niki〔4〕和Maekawa等〔9〕報道在肺腺癌VEGF-D的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯的相關(guān)。許多學(xué)者〔10〕認(rèn)為，上述結(jié)論不一致性主要是由于研究方法不同或是腫瘤之間VEGF-D的表達(dá)不均一。提示VEGF-D的表達(dá)可能是調(diào)控淋巴管生成的重要因子。Yokoyama等〔11〕報道VEGF-D通過與其在淋巴管和血管表達(dá)的特異受體結(jié)合建立的旁分泌途徑，調(diào)控腫瘤的淋巴管和血管生成。本研究結(jié)果提示，免疫組化和PCR研究結(jié)果是否一致很可能取決于所檢測部位，雖然通過QRT-PCR檢測，顯示VEGF-D mRNA表達(dá)水平不僅僅來源于腫瘤細(xì)胞，還有間質(zhì)細(xì)胞等陽性部位，但是癌侵犯邊緣VEGF-D mRNA同時高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯的相關(guān)性提示，VEGF-D的高表達(dá)有利于腫瘤淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管道轉(zhuǎn)移，同時提示對VEGF家族整體的研究也許比在實驗條件下單獨研究其中某一因子更為重要。

有研究〔5〕顯示腫瘤侵犯邊緣的高LWVD有可能決定著腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。雖然有一些關(guān)于NSCLC淋巴管生成的臨床材料研究〔3,4，12〕，但還沒有有關(guān)腫瘤邊緣LMVD與VEGF-D mRNA表達(dá)的相關(guān)性研究。

綜上，在NSCLC組織中VEGF-D的表達(dá)可能調(diào)控著腫瘤的淋巴管生成，癌侵犯邊緣VEGF-D的高表達(dá)可能與淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究也說明，VEGF-D 在NSCLC組織不同部位的表達(dá)有明顯的差異，對癌組織的不同部位選擇VEGF-D表達(dá)，會更加有利于評估患者的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。

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