陳建南 丁毅鵬

(海南省人民醫(yī)院急診科，海南 ?？?570311)

膿毒癥及其引起的多種器官功能障礙是感染、創(chuàng)傷、嚴重燒傷等危重患者死亡的主要原因之一〔1, 2〕。研究發(fā)現(xiàn)，一些創(chuàng)傷較嚴重的疾病并發(fā)膿毒癥的概率在逐年遞增，嚴重危害人類的生命。醫(yī)療界一直在尋找治療膿毒血癥的有效方法。脂聯(lián)素(ADP)是一種具有內(nèi)源活性的多肽，主要是由脂肪細胞分泌的。研究發(fā)現(xiàn)，很多慢性疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病等患者體內(nèi)的ADP水平較低，而炎癥因子的表達較高〔3,4〕。這兩者的變化是否與膿毒癥有關(guān)，目前研究較少。本研究采用大鼠膿毒血癥的模型，觀察大鼠的生存率以及組織中ADP以及炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平，初步探討膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展與ADP以及TNF-α表達水平之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗動物模型 取健康的雄性Wistar大鼠60只，體重200～300 g，隨機分成正常對照組、膿毒血癥組、生存率觀察對照組、生存率觀察膿毒血癥組，每組15只。兩組大鼠均采用七氟醚吸入麻醉后，尾靜脈注射內(nèi)毒素(LPS)或者生理鹽水。在注射后4、24 h分別處死大鼠，檢測血漿中ADP以及TNF-α的水平，組織中檢測ADP以及TNF-α mRNA的水平變化。另兩組生存率觀察組大鼠采用相同的飼養(yǎng)條件以及相同的處理方法，觀察其24 h的生存率。

1.2標本采集 大鼠采用七氟醚吸入麻醉后，抽取全血5 ml，1 200 r/min離心10 min，收集血漿，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，并且留取大鼠附睪脂肪組織，-80℃保存。

1.3RT-PCR檢測組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平 取脂肪組織80 mg，超聲勻漿后按照說明書用Trizol法提取RNA，LPS的上游序列為5′-TCCTGGTCACAATGGGATACC-3′，下游序列為5′-ATCTCCTGGGTCACCCTTAGG-3′， TNF-α的上游序列為5′-GTAGCCCACGTCGTAGCAAA-3′， 下游序列為5′-TGGTGAAAGACGCCAGTAGACTC-3′。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 40 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共32個循環(huán)，最后72℃ 10 min。

1.4ELISA法檢測血漿中ADP以及TNF-α的水平 按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠生存率及一般情況比較 正常組大鼠表現(xiàn)正常，而膿毒血癥組大鼠在造模后30 min開始出現(xiàn)豎毛、厭食、眼角分泌物增多等中毒癥狀，并且隨著時間的推移出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡、血尿等休克癥狀，嚴重者死亡；在24 h內(nèi)，正常對照組大鼠未發(fā)生死亡，膿毒血癥組大鼠死亡9只，死亡率為60%，說明大鼠膿毒血癥造模成功。見圖1。

2.2兩組大鼠血漿中ADP以及TNF-α的水平 膿毒血癥組大鼠血漿中ADP在注射4 h后開始下降，并持續(xù)下降至24 h時。而TNF-α的水平在注射4 h后顯著升高，在24 h時顯著下降，但與正常對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 兩組大鼠生存曲線

表1 兩組大鼠血漿中ADP以及TNF-α的水平

2.3兩組大鼠組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平 用RT-PCR的方法檢測兩組大鼠組織ADP以及TNF-α mRNA的水平發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥大鼠在注射LPS 4 h后，ADP的表達較正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TNF-α mRNA的表達顯著增高(P<0.05)；在注射LPS 24 h后，ADP的表達較正常對照組顯著下降，而TNF-α mRNA的表達仍顯著增高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠組織中ADP以及TNF-α mRNA的水平

2.4ADP以及TNF-α mRNA的水平與血漿中相應(yīng)指標水平的相關(guān)性分析 通過對兩者進行Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)膿毒血癥組大鼠組織中ADP mRNA水平與血漿中ADP的水平呈正相關(guān)(r=0.912，P=0.000)，TNF-α的相關(guān)性分析也呈相同的趨勢(r=0.823，P=0.000)。

3 討 論

目前對膿毒癥的研究主要集中實驗動物上，通常用對大鼠尾靜脈注射LPS造模形成大鼠膿毒血癥以供研究〔5,6〕。

ADP是一種由多種基因決定的內(nèi)源性生物活性多肽。在多種研究中發(fā)現(xiàn)，一些患糖尿病、動脈粥樣硬化、肥胖、冠心病的患者會表現(xiàn)出低ADP血癥，提示ADP與代謝性疾病有一定的關(guān)系〔7，8〕。本研究說明ADP的水平在膿毒癥這種急性炎癥中出現(xiàn)下降，提示機體內(nèi)ADP水平的高低可能影響了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

TNF-α是一種機體內(nèi)常見的致炎因子，ADP在體內(nèi)可以抑制TNF-α等致炎因子的表達，以減輕甚至終止炎性反應(yīng)，在機體的免疫反應(yīng)中也起著很重要的負性調(diào)節(jié)作用〔9,10〕。有研究表明，用藥物提高膿毒血癥大鼠血液中的ADP濃度可以提高大鼠的生存率，可能與其抑制炎癥因子的表達有關(guān)。本研究說明在膿毒癥大鼠的體內(nèi)，ADP與TNF-α的變化方向相反，提示在體內(nèi)兩種因子的表達相互拮抗，ADP有潛在的抗炎作用。

綜上，在膿毒癥大鼠體內(nèi)，ADP與TNF-α表達相互拮抗，可能在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在以后的治療過程中，可能通過提高血漿和組織中ADP的濃度或者增加ADP受體的敏感度來改善膿毒癥的治療效果。

4 參考文獻

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