劉振麗 姜 偉

(濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內一科，山東 濟寧 272000)

小細胞肺癌(SCLC)屬于神經內分泌腫瘤(約占15%)，其中未轉移病人的生存率為10%，只有不到10%的病人適合進行手術切除治療，而晚期SCLC患者的5年生存率僅2%，因此SCLC的轉移和進展研究是目前腫瘤基礎研究的重點之一〔1〕。組織因子信號通路抑制因子(TFPI)-2，是一種32 kD大小的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，分泌到細胞外基質(ECM)中，被認為是一種抑癌基因。因為TFPI-2可抑制血纖維蛋白溶解酶的活性，參與基質金屬蛋白酶(MMP)的激活〔2〕，調控ECM的降解和腫瘤細胞浸潤。大部分惡性腫瘤，例如神經膠質瘤、胰腺癌、肝細胞癌TFPI-2表達下調。在細胞中穩(wěn)定轉染或通過融合腺病毒導入TFPI-2后，可降低了癌細胞的浸潤性〔3〕，但目前，還沒有研究觀察TFPI恢復表達或者高表達對肺癌，特別是SCLC的進展影響。本研究檢測SCLC患者組織標本中TFPI-2的表達，評估恢復TFPI-2表達后NCI-H209細胞系移植瘤中腫瘤生長的情況。

1 材料與方法

1.1腫瘤組織標本 2012年2～8月通過支氣管鏡(n=33)和縱隔鏡(n=7)活檢獲得SCLC病例資料和標本。根據2004年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類標準，確定為原發(fā)性SCLC，男30例，女10例，35～84歲。中位年齡65歲，97%的病人是吸煙者。25例確診時處于晚期，且有轉移。僅有2例在最后一次隨訪時仍存活，且病例數據可用。中位總生存期為6個月，2年生存率為5.5%。臨床數據記錄齊全，有可用于免疫組織化學分析的組織標本。查閱病人治療記錄，收集如下相關數據：確診時年齡、性別、吸煙史、相關并發(fā)癥、腫瘤分級和轉移、最后一次隨診或死亡時間。腫瘤分期根據2004年WHO推薦的Veterans’ Administration Lung Study Group(VALSG)標準進行。研究經過我院的倫理委員會批準，并由患者簽署知情同意書。

1.2細胞培養(yǎng)和轉染 SCLC細胞系NCI-H209購自ATCC(LGC Promochem，Molsheim，法國)，在37℃含有5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。使用4 μg pCMV-luc plasmid(Clontech，Saint Quentin en Yvelines，法國)質粒，以Lipofectamine2000(Invitrogen)作為轉染劑，根據試劑說明書進行轉染后使用G418篩選穩(wěn)定高表達熒光素酶(NCI-H209 Luc cells)的細胞，獲得穩(wěn)定轉染克隆后用含50 μg/ml G418(Invitrogen)進行培養(yǎng)。NCI-H209 Luc細胞轉染4 μg pEF6/V5-His TOPO質粒(Invitrogen)，包含有TFPI-2 cDNA 或空白質粒兩種，3 w后獲得轉染成功的細胞克隆，選擇穩(wěn)定轉染高TFPI-2的細胞克隆。用反轉錄和實時PCR、Western印跡、免疫組織化學染色檢測TFPI-2的表達，最終形成3個克隆，即含空白轉染質粒的細胞852(不表達TFPI-2)及編碼TFPI-2的質粒轉染形成表達TFPI-2的兩個細胞克隆(T6、T28)用于進一步的實驗。通過qPCR檢測發(fā)現，T6克隆TFPI-2的表達量(138 980拷貝)最高(圖1)。T28克隆中TFPI-2 蛋白沒有T6克隆表達強(46 780拷貝)，而852細胞中無TFPI-2的表達。T28和T6克隆中TFPI-2 mRNA表達相對于852細胞，升高6 000倍和18 000倍。

圖1 表達不同量的TFPI-2的人SCLC高致瘤性NCI-H209 Luc細胞

1.3SCLC裸鼠移植瘤實驗 4 w齡無病原菌雄性BALB/c裸鼠，在無菌飼養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定2 w，根據國家研究機構指南進行飼養(yǎng)。所有實驗步驟獲得了倫理委員會相關授權者的監(jiān)督并同意后進行。移植前，NCI-H209 Luc細胞離心后收集(3 min，200 r/min)，并用無FCS培養(yǎng)基洗兩次，胎盤藍染色后進行細胞活力計數(>95%)。將細胞穩(wěn)定轉染表達熒光素酶的質粒中的一個克隆注射通過氣管插管注射到小鼠肺部，并同時皮下注射到小鼠背部，觀察腫瘤的生長情況。

1.4生物熒光顯影 注射100 mg/kg D-熒光素(Promega，Charbonnieres，法國)，將小鼠用2%的異氟烷麻醉4 min后，進行生物熒光顯影。使用IVIS Lumina儀器(Caliper LS，Hopkinton MA，USA)顯示低密度區(qū)和疊加層灰度參考圖像，計算肺部區(qū)域(Living Image software，V.2.GO，CaliperLS)的所有電子總和的信號強度。采用微型計算機斷層掃描(CT)檢測腫瘤的部位，并測量。根據圖像中腫瘤的寬度(W，軸向)、高度(H，中-矢狀)、長度(L，中-矢狀)測量腫瘤大小和體積，公式4/3π(W/2×H/2×L/2)。

1.5小鼠標本收集和組織病理分析 小鼠在麻醉狀態(tài)下斷頸處死，開腹，檢測喉、體腔中是否有轉移癌，保存每只老鼠的肺、氣管、肝、脾、腦。所有器官用10%甲醛溶液浸泡后，用石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，并用標準HES染色程序進行染色。使用Lab Vision Autostainer(Lab Vision 公司)自動染色機進行免疫組織化學染色，用生物素-地高辛免疫組化學檢測體系和二氨基聯(lián)苯胺作為底物進行顯色(UltraVision，Lab Vision公司)。切片蘇木素復染。半定量分析細胞核和細胞質的著色強度，得分范圍0～3(無著色=0，弱著色=1，中度著色=2，強染色=3)。通過將表達熒光素的細胞種植到裸鼠皮下進行研究觀察腫瘤的生長狀況，每隔2 w，用生物發(fā)光圖像進行檢測。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗(雙尾)，或Mann Whitney檢驗。

2 結 果

2.1人小細胞肺癌中TFPI-2 和MMP的表達 26例低表達TFPI-2(染色強度，細胞核0，細胞質1)，14例高表達TFPI-2，包括1例染色強度為3的病例。50%的標本中MMP-1高表達(圖1)。MMP-2、-3、-9的染色強度為1的病例分別占50%、57.5%、61.5%。SCLC病例中TFPI低表達(染色強度0，1)標本中，有88%的樣本MMP-1高于TFPI-2(染色強度2)。在高表達TFPI-2(染色強度2，3)的組織中，MMP的染色強度普遍低于TFPI-2(染色強度0，1)。見圖2。

圖2 免疫組織化學分析SCLC樣本

2.2TFPI-2上調表達降低了裸鼠移植瘤的發(fā)展 手術后，有1只小鼠死亡，2只小鼠死于腫瘤生長過程。9 w后，95%的小鼠都長出了腫瘤，氣道生物熒光較弱小鼠占5%。在852對照細胞小鼠移植瘤中，移植3 w時，生物熒光強度最強，7～9 w時熒光強度穩(wěn)定(表1)。而T6克隆3 w時熒光強度較弱，隨后開始增強，但7 w時仍顯著低于852細胞。應用CT掃描腫瘤部位和大小。所有動物，腫瘤位于肺底部和中部，生物熒光和CT測量的腫瘤大小有很好的一致性(r=0.87)。T6克隆的小鼠腫瘤明顯小于852小鼠。小鼠標本的組織化學切片分析表明，腫瘤邊界清晰。支氣管受壓迫，肺泡受到浸潤和破壞。移植瘤中部出現壞死，特別是852細胞，周圍有大量巨噬細胞。9 w時體內腫瘤切片進行了免疫組化染色分析TFPI-2的表達，在T6細胞形成的腫瘤中高表達(圖3)。

表1 852和T6細胞熒光強度比較

圖3 表達TFPI-2和不表達TFPI-2的NCI-H209細胞成瘤生長情況

3 討 論

TFPI-2是一種潛在的血纖維蛋白溶解酶抑制因子，可以通過激活MMPs參與腫瘤進展的蛋白酶，因此，TFPI-2是一種潛在的腫瘤浸潤和轉移的抑制因子。在諸如神經膠質瘤、黑色素瘤、肝細胞癌、非小細胞肺癌的惡性腫瘤中低表達〔4〕。但是，SCLC作為一種惡性程度最高的肺癌，受限于標本來源，對TFPI-2在腫瘤進展中的作用機制研究甚少〔5〕。本研究提示TFPI低表達與腫瘤的預后不良有關。TFPI-2的低表達可能是由于啟動子的甲基化造成，尤其是在非SCLC(NSCLC)晚期病人中。一項研究也發(fā)現：TFPI-2啟動子區(qū)的甲基化同NSCLC病人的預后差顯著相關，表明TFPI-2基因的甲基化或TFPI-2的表達或許是預后差的獨立預測因子。NCI-H209細胞系來源小細胞肺癌骨轉移的病人，該細胞體積小，有顯著的神經內分泌特性，培養(yǎng)時聚集生長，邊界不規(guī)則〔6〕?；蚪M測序表明，NCI-H209細胞RB1和TP53缺失，因而該細胞系能夠代表該疾病的所有特征〔7〕。當有組織壞死出現時，低發(fā)射光通過氧化熒光素酶底物，可降低了ATP的消耗，因此，使腫瘤細胞的數目減少。但借助2D生物熒光成像和掃描技術，仍可以清楚地證明TFPI-2表達的腫瘤細胞腫瘤體積小。對纖維肉瘤中也證實TFPI-2的恢復表達能夠降低腫瘤的生長速度〔8〕。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種機制，包括細胞增殖和凋亡，細胞遷移和浸潤。在這個過程中包含了ECM被一系列的諸如MMP蛋白酶的降解。在胰腺癌、食管癌、鼻咽癌、前列腺癌中發(fā)現TFPI-2的表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖。一些研究對其機制進行了研究〔9〕，發(fā)現TFPI-2可降低了細胞的增殖能力，將細胞阻斷在G1/S期，這同細胞周期依賴的激酶抑制因子p15和p27有關。p27(通過調控CDK2將細胞阻斷在G1/S期)在細胞周期中的調控作用，例如在胰腺癌和纖維肉瘤中，都已經有報道〔10〕。有研究通過腺病毒，將p27轉入NSCLC細胞中，使細胞停滯在G1/S期，并抑制了裸鼠移植瘤的增長。說明p27的低表達同病人預后差有關，在NSCLC中，p27表達高，病人生存期長。這也是TFPI-2腫瘤制效應的機制之一〔11〕。

腫瘤細胞的浸潤和進展也需要ECM降解，主要是通過蛋白酶，特別是MMP。研究報道〔12〕，TFPI-2是一種MMP活性的抑制因子，主要通過抑制纖溶酶來抑制MMP-1、-2、-3、-9。另外，除直接抑制外，TFPI-2也抑制MMP-1和-3的表達，來抑制腫瘤的增殖。SCLC手術切除標本稀少，主要是支氣管鏡和縱隔鏡檢查標本，因此僅僅夠用于免疫組織化學分析。TFPI-2對MMP表達的影響仍需要進一步的研究。

4 參考文獻

1Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2012；62(1)：10-29.

2Sutherland KD，Berns A.Cell of origin of lung cancer〔J〕.Mol Oncol，2010；4(5)：397-403.

3Travis WD.Advances in neuroendocrine lung tumors〔J〕.Ann Oncol，2010；21(7)：65-71.

4Planchard D， Le Pechoux C.Small cell lung cancer，new clinical recommendations and current status of biomarker assessment〔J〕.Eur J Cancer，2011；47(Suppl3)：S272-83.

5Hibi K，Goto T，Kitamura YH，etal.Methylation of TFPI2 gene is frequently detected in advanced well-differentiated colorectal cancer〔J〕.Anticancer Res，2010；30(4)：1205-7.

6Jia Y，Yang Y，Brock MV，etal.Methylation of TFPI-2 is an early event of esophageal carcinogenesis〔J〕.Epigenomics，2012；4(2)：135-46.

7Takada H，Wakabayashi N，Dohi O，etal.Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aber-rant promoter hypermethylation in gastric cancer〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2010；197(1)：16-24.

8Kisiel JB，Yab TC，Taylor WR，etal.Stool DNA testing for the detection of pancreatic cancer，assessment of methylation marker candidates〔J〕.Cancer，2011；118(10)：2623-31.

9Ma S，Chan YP，Kwan PS，etal.MicroRNA-616 induces androgen-independent growth of prostate cancer cells by suppressing expression of tissue factor pathway inhibitor TFPI-2〔J〕.Cancer Res，2011；71(2)：583-92.

10Tang Z，Geng G，Huang Q，etal.Expression of tissue factor pathway inhibitor 2 in human pancreatic carcinoma and its effect on tumor growth，invasion，and migration in vitro and in vivo〔J〕.J Surg Res，2011；167(1):62-9.

11Iochmann S，Lerondel S，Blechet C，etal.Monitoring of tumour progression using bioluminescence imaging and computed tomography scanning in a nude mouse orthotopic model of human small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2011；77(1)：70-6.

12Vaitkiene P，Skiriute D，Skauminas K，etal.Associations between TFPI-2 methylation and poor prognosis in glioblastomas〔J〕.Medicina (Kaunas) ，2012；48(7)：345-9.