劉 潤(rùn) 郭 超 趙 英

(甘肅中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，甘肅 蘭州 730000)

植物雌激素金雀異黃素(GS)是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的植物界抗癌成分的首選物質(zhì),其具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)多種來源腫瘤細(xì)胞凋亡的作用〔1，2〕。這主要與它的弱雌激素作用和抗雌激素樣作用、抑制生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期等〔3〕有關(guān)，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡抑制是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的核心和本質(zhì)，應(yīng)用藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤及耐藥逆轉(zhuǎn)的新途徑〔4〕。本課題探討GS誘導(dǎo)K562和K562/ADM細(xì)胞凋亡通路的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 GS，純度98%，用無水乙醇配成1×104μmol/L的貯存液，MTT、瓊脂糖、溴乙啶(EB)、碘丙啶(PI)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DNA抽提試劑盒購自上海生工生物公司；鼠抗人Bcl-2單抗(即用型)、兔抗人Bax單抗(即用型)、免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) K562和K562/ADM細(xì)胞株由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。細(xì)胞接種于含15%新生小牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)液中，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。定期加入阿霉素(3～6 g/ml)以維持其耐藥性，去除阿霉素后繼續(xù)培養(yǎng)2 w后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中乙醇的最大終濃度為0.1%。

1.3MTT比色法 把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以密度1×104/ ml 200 μl /孔接種于96孔培養(yǎng)板中，對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組在不同濃度的GS作用24、48、72 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上于570 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和IC50。

1.4流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞凋亡 各組收集處理48 h 2×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌。制成單細(xì)胞懸液，70%冷乙醇固定過夜，PBS洗滌，PI染色，上機(jī)檢測(cè)。

1.5親和素-生物素-酶復(fù)合物(ABC)法觀察Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 各組收集處理48 h 1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌,在細(xì)胞涂片離心機(jī)的樣品容器中每孔加200 μl細(xì)胞懸液涂片(800 r/min,4 min)，丙酮固定。采用親和素-生物素-酶復(fù)合物法(ABC),嚴(yán)格按試劑盒操作程序操作，DAB顯色。PBS代替一抗設(shè)陰性對(duì)照。顯色時(shí)鏡下控制。脫水、透明、封片。結(jié)果判定：以胞核、胞質(zhì)棕黃染色且背景清晰者為陽性信號(hào)，陽性細(xì)胞數(shù)≥25%為陽性。

2 結(jié) 果

2.1GS對(duì)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)抑制作用 GS對(duì)K562及K562/ADM細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，對(duì)K562及K562/ADM細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與濃度呈正相關(guān)，GS對(duì)K562/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為1.67倍，說明K562/ADM細(xì)胞株是多藥耐藥表型的細(xì)胞系，提示K562細(xì)胞對(duì)GS比K562/ADM細(xì)胞敏感，K562/ADM細(xì)胞對(duì)GS同樣存在耐藥現(xiàn)象。見表1。

2.2FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡 GS作用K562細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率有時(shí)間與濃度依賴性，可見亞G1期細(xì)胞增多，GS 75 μmol/L時(shí)為27.3%，高于GS同濃度下作用K562/ADM細(xì)胞時(shí)的5.4%(P<0.05)，說明GS更易誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡；S期細(xì)胞減少，G2M期細(xì)胞增多，提示細(xì)胞發(fā)生G2M期阻滯。而 GS作用K562/ADM細(xì)胞，細(xì)胞組間凋亡率沒有明顯變化，但細(xì)胞發(fā)生明顯的G2M期阻滯。見表2。

2.3Bcl-2和Bax蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，不同濃度GS對(duì)K562細(xì)胞的Bax蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)率100%，對(duì)照組幾乎不著色；Bcl-2蛋白實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組比較顏色無明顯變化；而在K562/ADM細(xì)胞中，Bcl-2在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均強(qiáng)表達(dá)，但Bax的表達(dá)均無明顯變化(圖1、圖2)。

表1 GS對(duì)K562細(xì)胞及K562/ADM細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)抑制作用

表2 GS對(duì)K562和K562/ADM細(xì)胞周期分布的影響

圖1 各組K562細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)(DAB,48 h,×400)

圖2 各組K562/ADM細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)(DAB,48 h,×400)

3 討 論

白血病細(xì)胞發(fā)生耐藥的信號(hào)途徑及調(diào)控機(jī)制仍不甚明了，凋亡抑制是白血病細(xì)胞耐藥形成的重要機(jī)制之一〔5〕，凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax是同一家族作用完全相反的蛋白，兩者之間表達(dá)量的平衡關(guān)系決定細(xì)胞的生存或凋亡。Bcl-2是廣義的抑制凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同二聚體增高，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔6〕。細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物敏感性和耐受性密切相關(guān)。本研究觀察到K562/ADM細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2蛋白，GS并不能誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化，提示K562/ADM細(xì)胞的耐藥性和凋亡抑制與Bcl-2蛋白高表達(dá)有關(guān)。GS通過上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)量，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)量，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，通過GS對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，說明GS可作用于細(xì)胞周期信號(hào)系統(tǒng)，干擾細(xì)胞周期時(shí)相的協(xié)調(diào)進(jìn)行，形成K562細(xì)胞對(duì)GS比K562/ADM細(xì)胞敏感，K562/ADM細(xì)胞對(duì)GS同樣存在耐藥的現(xiàn)象，提示GS主要通過生長(zhǎng)抑制、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制白血病細(xì)胞的增殖。GS作用的機(jī)制有助于臨床克服抗腫瘤藥物的耐藥性提供新的途徑。

4 參考文獻(xiàn)

1Kousidou OC,Mitropoulou TN,Roussidis AE,etal.Genistein suppress the invasive potential of human breast cancer cells through transcriptional regulation of metalloproteinases and their tissue inhibitors〔J〕.Int J Oncol,2005;26(4)：1101-9.

2鐘興蘭，王新娟，姚偉娟，等.金雀異黃素對(duì)小鼠紅白血病細(xì)胞系MEL的抑制作用〔J〕.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2003；19(1)：112-7.

3范玉貞,王玉華.金雀異黃素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志,2008；22(1)：72-5.

4Johnstone RW，Ruefli AA，Lowe SW.Apoptosis：a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕.Cell Biochem，2002；108(2):153-64.

5Gadducci A，Cosio S，Muraca S，etal.Molecular mechanisms of apoptosis and chemsensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer：biological and clinical implications〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2002；23(5):390-6.

6Yang LJ,Wang WL.Establishment of the hepatoma cells which express Bax protein Stably and highly and observation of its apoptotic phenomena〔J〕.J Fourth Mil Med Univ,2002；23(5):455-8.