陳云峰 朱述陽 劉向群 劉文靜 吳 瑕 倪文靜

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

研究證實肥胖是支氣管哮喘(簡稱哮喘)的危險因素，并且可使哮喘發(fā)展為難治性哮喘〔1〕，而瘦素(LP)是脂肪組織表達的促炎分子的中心成員，在哮喘發(fā)病中具有重要的作用，能夠促進多種炎癥介質(zhì)的釋放，并可促進氣道平滑肌細胞的增殖〔2〕，其在血清濃度升高可導(dǎo)致肺功能下降。β2腎上腺素能受體(β2-AR)在肺內(nèi)分布廣泛，哮喘的發(fā)作與β2-AR失常有密切聯(lián)系〔3〕。β2-AR與肺功能密切相關(guān)，在哮喘急性發(fā)作時β2-AR數(shù)量減少，使細胞內(nèi)環(huán)磷腺苷(cAMP)下降，這是支氣管痙攣的重要原因。多種炎癥介質(zhì)可以抑制β2-AR的表達，如白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。有研究顯示，肥胖時β2-AR表達降低并且存在基因多態(tài)性變化，但其作用機制尚不明確，考慮可能與LP有關(guān)。本實驗擬從細胞水平研究LP對大鼠氣道平滑肌β2-AR表達的影響，進一步了解LP在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 150～200 g SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)；LP(Alexis公司)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司 )；兔抗大鼠β2-AR(武漢博士德公司)；胎牛血清(杭州四季青有限公司 )；胰蛋白酶(Sigma 公司)；PBS(北京中杉公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒；RT-PCR一步法檢測試劑盒(北京天根公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司)；瘦素拮抗劑(ProSpec-Tany公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠氣道平滑肌細胞(ASMCs)的培養(yǎng) 將大鼠用水合氯醛麻醉后，在無菌條件下縱行剖開氣管，小心剝離外膜，并輕輕刮除內(nèi)膜，用眼科剪將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，將組織塊移入培養(yǎng)瓶瓶底，等距排列，倒置培養(yǎng)瓶，加入含25%胎牛血清的培養(yǎng)液3 ml，將貼有組織塊的一側(cè)朝上，使其不與培養(yǎng)液接觸，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，3 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，半開放式靜置培養(yǎng)3 d后將培養(yǎng)液添至5 ml，繼續(xù)置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，第6天全換液，此后每3 d換液1次。ASMCs通過傳代自然純化，實驗用第4～6代細胞。隨機分為空白對照組(A組)，LP 50、100、200 ng/L組(B、C、D組)及LP拮抗劑組(LP 200 ng/L+LP拮抗劑200 ng/L，E組)。

1.2.2細胞鑒定 ①細胞形態(tài)學(xué):應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察，觀察細胞的大小、形態(tài)及排列方式等。②免疫熒光染色法:將消毒好的大小合適的玻片放入六孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)，把收集好的細胞加入孔內(nèi)，加入2 ml高糖培養(yǎng)基。待細胞融合約50%～60%時取出玻片,加入37 ml/L甲醛液在室溫下固定30 min，用100 ml/L山羊血清(PBS配制)封閉非特異性抗原30 min，抗SMC-α-actin(1∶200 PBS稀釋)室溫下孵育細胞2 h，用熒光標(biāo)記二抗(1∶200 PBS稀釋)在4℃孵育細胞過液，然后用熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下檢測。

1.2.3Western印跡法測定瘦素受體(Ob-R)及β2-AR的蛋白表達 按照實驗分組干預(yù)24 h后提取細胞蛋白。依次經(jīng)配膠、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及封閉后，分別加入兔抗大鼠β2-AR抗體過夜，洗膜后，加入二抗(小鼠抗兔IgG)孵育2 h，以NBT/BCIP顯色后用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.2.4實時熒光半定量PCR測定Ob-R及β2-AR的表達 熒光實時定量RT-PCR 法測定：分組同上，干預(yù)24 h后收集ASMCs，TRNzol法提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度。擴增β2-AR基因引物序列：上游：5′-GAGACCCTGTGCGTGATTGC-3′；下游；5′-CCTGCTCCACCTGGCTGAGG-3′擴增產(chǎn)物長度265 bp；擴增內(nèi)參照β-actin基因引物序列:上游：5′-ACTCAGGAACGGGACGAA-3′；下游：5′-TGATTGCAGTGGATCGCTA-3′擴增產(chǎn)物長度257 bp。PCR擴增條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，72℃ 60 s，共進行40個循環(huán)。擴增Ob-R基因引物序列：上游：5’-CAGATTCGATATGGCTTAAATGG-3’，下游：5’-GTTAAAATTCACAAGGGAGGCA-3’，擴增產(chǎn)物長度 474 bp。擴增內(nèi)參照β-actin基因引物序列:上游：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，擴增產(chǎn)物長度為473 bp。Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。采用相對定量方式表示各組β2-AR mRNA表達。檢測結(jié)果以每個樣本目的基因CT平均值減去內(nèi)參CT平均值，對應(yīng)為每個樣本的CT值(△Ct)。

2 結(jié) 果

2.1ASMCs鑒定 在倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的ASMCs呈梭形，平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯呈“峰谷”狀。免疫熒光染色法表明，抗平滑肌肌動蛋白抗體呈陽性染色者，胞質(zhì)內(nèi)可見大量綠色熒光，證實所培養(yǎng)細胞為ASMCs(圖1)。

2.2Western印跡法檢測β2-AR及Ob-R蛋白的表達 與A組相比，Ob-R蛋白表達逐漸升高(P<0.05)；予LP拮抗劑后，Ob-R表達較LP干預(yù)組降低(P<0.05)，較A組無顯著差異(P<0.05)。與A組相比，β2-AR蛋白表達逐漸降低(P<0.05)；予LP拮抗劑后，β2-AR表達較LP干預(yù)組升高(P<0.05)，較A組無顯著差異(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖1 ASMCs的鑒定(×100)

1～5:A、B、C、D、E組

1～5：A、B、C、D、E組

2.3實時熒光半定量RT-PCR測Ob-R及β2-AR mRNA的表達 與A組相比,B、C、D組Ob-R表達明顯升高，而β2-AR表達下降，證實LP可以上調(diào)Ob-R的表達并抑制β2-AR的表達；E組Ob-R表達較B、C、D組下降(P<0.05)，與A組相比(P>0.05)；E組β2-AR表達較B、C、D組升高(P<0.05)，與A組相比(P>0.05)。見表1。

表1 Ob-R及β2-AR的相對表達量值)

3 討 論

1980～2008年，兒童中哮喘的發(fā)病率從3.5%上升至9.4%，在成人中由2.9%升高至7.3%〔2〕。與此同時，在美國20歲以上的成年人中，接近65%為超重或者肥胖的，這一數(shù)據(jù)與10年前相比升高了10%〔4〕。肥胖是哮喘的危險因素之一〔5，6〕，并且加重了哮喘的嚴(yán)重程度〔7〕。肥胖對哮喘的影響有很多方面，炎癥因素是肥胖促進哮喘的主要機制。吸入糖皮質(zhì)激素、β2腎上腺素能受體激動劑和膽堿能受體拮抗劑是目前用來治療哮喘的最基本藥物，主要通過抑制氣道炎癥和擴張支氣管而改善哮喘癥狀。與正常體重患者相比，肥胖的哮喘患者需要應(yīng)用更大劑量的β2-AG及激素〔8〕。有研究顯示，減肥可以減輕哮喘的嚴(yán)重程度及癥狀〔9，10〕。

LP是脂肪組織表達的促炎分子的中心成員，肥胖患者的血清LP水平比正常人高4～6倍〔11〕。LP主要通過作用于Ob-R而發(fā)揮作用，在氣道平滑肌細胞中存在Ob-R的表達。徐成勝等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)LP可在體外上調(diào)血管平滑肌細胞Ob-R的表達，但在氣道平滑肌細胞中研究甚少，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，LP干預(yù)后可于體外上調(diào)氣道平滑肌細胞Ob-R表達。LP在哮喘的發(fā)病過程中起重要的作用，它可以刺激促炎細胞因子的產(chǎn)生，如IL-6，TNF-α，白三烯等〔13，14〕，并且可以促進氣道平滑肌細胞的增殖。同時平滑肌細胞表形的改變可能是決定重度哮喘對激素敏感性較差的原因之一〔15〕。研究證實，血清LP濃度與肺功能密切相關(guān)，降低血清LP水平可使肺功能升高。

β2-AR是一種G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)，GPCRs關(guān)聯(lián)著體內(nèi)信號傳導(dǎo)、細胞增殖、分化和凋亡、損傷后修復(fù)等諸多過程，β2-AR廣泛分布于支氣管平滑肌和肺組織內(nèi)，β2-AR的數(shù)量與肺功能呈負相關(guān)。當(dāng)哮喘發(fā)作時，受反復(fù)使用β2-AG及多種炎癥介質(zhì)，如白三烯、前列腺素等作用的影響，使β2-AR含量明顯降低〔16〕，導(dǎo)致氣道平滑肌痙攣，過敏介質(zhì)釋放增加，黏膜水腫和黏液分泌增加等病理變化。在外周白細胞β2-AR的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1，TNF-γ及GM-CSF均可影響其功能。有研究〔17〕證實豚鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的氧自由基數(shù)量級氣道β2-AR功能損害程度之間存在密切相關(guān)，用大鼠進行的實驗也顯示了氧自由基可致β2-AR密度降低。β2-AG是目前臨床應(yīng)用最廣的支氣管解痙劑，已廣泛應(yīng)用于支氣管哮喘的急性發(fā)作的治療，可以有效地緩解哮喘的急性癥狀，并且可以抑制氣道平滑肌細胞增殖。β2-AG治療支氣管哮喘的藥理機制是通過選擇性刺激氣道內(nèi)的β2-AR，從而松弛氣道平滑肌，達到支氣管擴張效應(yīng)〔18〕。在肥胖的哮喘患者中發(fā)現(xiàn)，其對β2-AG的反應(yīng)性降低，與研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果提示LP可以呈濃度依賴性抑制氣道平滑肌細胞β2-AR的表達?？赡艿臋C制有：①LP可能通過上調(diào)PKA，使其介導(dǎo)的受體磷酸化后被吞，并被傳輸?shù)饺苊阁w后被降解，也有可能是通過cAMP途徑使β2-AR表達降低。②LP可能通過PI3K通路，作用于Rho蛋白家族調(diào)節(jié)β2-AR的表達。本實驗以體外培養(yǎng)細胞觀察到了這一現(xiàn)象，與動物模型及人類有一定的差別，所以下一步可以通過動物模型及人體實驗等進行研究，進一步探討了LP在支氣管哮喘發(fā)病中的作用，為哮喘的預(yù)防提供了一個新的思路。

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