何建華 胡明財(cái) 孫玉紅 秦超超 李曉冰

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 瀘州 646000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變 (DPN)是2型糖尿病(T2DM)主要并發(fā)癥，也是患者致殘的常見原因, 60%～90%的患者通過神經(jīng)功能檢查, 均有不同程度的神經(jīng)病變〔1〕。六味地黃丸出自宋·錢乙的 《小兒藥證直訣》, 是滋補(bǔ)肝腎的著名方劑。本實(shí)驗(yàn)觀察T2DM大鼠坐骨神經(jīng)組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)的表達(dá)，探討六味地黃丸對(duì)DPN治療作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)，批號(hào)：120112，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；六味地黃丸，批號(hào)：120142，河南宛西制藥股份有限公司；糖末寧顆粒，批號(hào)：20120903，遼寧奧達(dá)制藥有限公司；膽固醇，批號(hào)：120920；膽酸鈉，批號(hào)：120920，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司?？俁NA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；批號(hào)：201211；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Sigma；DNA Marker 天根生化科技(北京)有限公司；批號(hào)：201211。

1.2儀器 電子天平FA1604N,0.1 mg,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。微孔板檢測(cè)系統(tǒng) Sepctra Max M3，美國(guó) Molecular Devices；ND-1000微量紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Nanodrop公司； 全自動(dòng)酶標(biāo)儀WD-2102A型, 杭州匯爾儀器；ECHNE TC-412PCR儀，英國(guó)TECHNE；漩渦混合器，上海青浦滬西儀器廠XW-80A；ChampChemi系列化學(xué)發(fā)光、熒光凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智；電泳儀、電泳槽，美國(guó)Bio-Rad。

1.3動(dòng)物模型的建立與分組給藥 SD大鼠，雄性，體重130～150 g,SPF級(jí)，購(gòu)自重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0006。 大鼠80只適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組。對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料，用高脂高糖飼料飼喂造模組(2.5%膽固醇、10%豬油、20%蔗糖、1%膽酸鈉，其余66.5%為基礎(chǔ)飼料)飼養(yǎng)8 w；后空腹12 h，按照劑量20 mg/kg腹腔注射STZ(臨用前配制，溶于0.1 mol/L、pH=4.2的無(wú)菌檸檬酸緩沖液)，對(duì)照組注入等容量檸檬酸緩沖液。72 h后檢測(cè)所有大鼠的空腹血糖(FPG)值,稱取大鼠體重測(cè)量體長(zhǎng)，并用lee指數(shù)公式(Lee指數(shù)=〔體重(g)×103/體長(zhǎng)(cm)〕1/3)計(jì)算大鼠體重指數(shù)(BMI),以BMI明顯高于對(duì)照組大鼠和FPG>11.0 mmol/L雙重指標(biāo)為大鼠模型成功標(biāo)準(zhǔn)。選擇造模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組、糖末寧組(人體等效劑量)、六味地黃丸中劑量(為人體等效劑量)，六味地黃丸低劑量(1/2倍等效劑量)、六味地黃丸高劑量(2倍等效劑量)并設(shè)置正常對(duì)照組，每組大鼠10只。成模大鼠穩(wěn)定1 w后開始灌胃給藥。稱取大鼠體重并標(biāo)記后按人體與大鼠體表面積比值表?yè)Q算出大鼠的等效劑量〔2〕，各干預(yù)組灌胃相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組及模型組灌胃等容積生理鹽水，1次/d，連續(xù)8 w。

1.4大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF及胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1的RT-PCR測(cè)定

1.4.1組織勻漿 給藥8 w后，動(dòng)物做其他指標(biāo)檢測(cè)后處死，取其坐骨神經(jīng)組織，將組織在液氮中快速磨碎，然后按照劑量1 ml/100 mg加入裂解液RZ，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過裂解液RZ體積的1/10。將加入RZ裂解液的勻漿液在室溫15～30℃溫度下放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

1.4.2總RNA提取 將樣品裝于EP管中，按照4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清移到另一個(gè)無(wú)RNase的1.5 ml的EP管內(nèi)，再往此EP管內(nèi)加入200 μl氯仿，蓋好管蓋，振蕩15 s室溫放置3 min。再于4℃12 000 r/min離心10 min，小心吸取上層無(wú)色的水相。再把水相移至另外一個(gè)無(wú)RNase的1.5 ml EP管內(nèi)。緩慢加入約為水相0.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CR3內(nèi)，接入2 ml的收集管內(nèi)，4℃12 000 r/min離心30 s，棄上清。向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RD，于4℃12 000 r/min離心30 s，棄上清。再向吸附柱CR3中加入700 μl漂洗液RW，溫室靜置2 min，后于4℃12 000 r/min離心30 s，棄上清。重復(fù)以上操作，于超凈臺(tái)上通風(fēng)1 min，予以充分晾干。將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的收集管內(nèi)，加入50 μl的RNase-free ddH2O，室溫放置2 min充分溶解RNA，后于4℃12 000 r/min離心2 min。在-80℃冰箱保存所提取的RNA。用ND-1000微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的RNA濃度。

1.5逆轉(zhuǎn)錄 按試劑盒操作，配制逆轉(zhuǎn)錄體系。取總RNA 5 μl (1 μg /μl) 加入5 μl Oligo(dT) 18(1 μg /μl) ,70℃變性5 min后置于冰上, 加MgCl24.0 μl ，10×RT 緩沖液2.0 μl ，dNTP 混合物2.0 μl, 無(wú)酶H2O 9.5 μl ，RNase 抑制劑0.5 μl，Random 9 mers 1.0 μl ，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，總反應(yīng)體系25 μl, 混勻后依次置于30℃10 min、50℃30 min、99℃5 min，5℃5 min反應(yīng)環(huán)境, 最后置于冰上。

1.6引物設(shè)計(jì)與合成 NGF上游引物5′-CGGCTTTGGTGACTGGATAG-3′，下游引物5′-TGAGGACCAGAGCAGACAGG-3′；IGF-1 上游引物5′-GCACCTCCAATAAAGATACAC-3′，下游引物5′-AACTGAAGAGCGTCCACC-3′，內(nèi)參β-actin上游引物5′-AAACTCGGCACAGTT ATT-3′，下游引物5′-TATACAGCCTAGCATCCC-3′。以上引物由上海生物有限公司合成。

1.7PCR擴(kuò)增 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl進(jìn)行PCR 反應(yīng)，加入反應(yīng)緩沖液5 μl (含Mg2+) ，dNTP(10 mmol/L) 2 μl,Taq 酶(5 U/μl)1 μl , 引物( 25 pmol/μl) 1 μl, 去離子水25 μl, 總反應(yīng)體積為40 μl。放入PCR 儀, 分別執(zhí)行下列反應(yīng)程序: NGF: 94℃30 s、56.8℃ 30 s、72℃2 min；IGF-1∶94℃30 s、53.7℃ 30 s、72℃2 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán), 72℃延伸6 min； β-actin：94℃30 s、56℃ 30 s、72℃2 min擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。

1.8電泳及圖像分析 取5 μl的PCR產(chǎn)物，加1 μl的上樣緩沖液，加入瓊脂糖制備的凝膠板的樣品孔內(nèi)，110 mV 電泳30 min。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察掃描，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Bio-Rad 公司Quantity One軟件分析，測(cè)定電泳條帶的平均灰度值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)各樣本NGF、IGF-1和β-actin電泳條帶的光密度值比。

1.9統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行多樣本間單因素方差分析和兩樣本間t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.12型糖尿病大鼠造模結(jié)果 造模組大鼠FPG〔(16.99±3.62)mmol/L〕明顯高于空白對(duì)照組〔(5.72±0.50)mmol/L〕(P<0.01)，各造模組大鼠BMI與空白對(duì)照組相比〔(311.53±19.01) vs (288.48±26.89) g/cm〕明顯升高(P<0.01)。

2.2大鼠坐骨神經(jīng)組織IGF-1 mRNA和NGF mRNA的PCR電泳結(jié)果 擴(kuò)增后得到β-actin 450 bp和IGF-1 137 bp兩個(gè)片段，內(nèi)參β-actin與IGF-1/NGF的擴(kuò)增條件完全一致。見圖1。

a，高劑量組；b，中劑量組；c，低劑量組；d，模型組；e，空白對(duì)照組；f，糖末寧組

a，空白對(duì)照組；b，模型組；c，低劑量組；d，中劑量組；e，高劑量組；f，糖末寧組

2.3藥物對(duì)T2DM大鼠坐骨神經(jīng)組織IGF-1 mRNA和NGF mRNA相對(duì)表達(dá)的影響 模型組大鼠與空白對(duì)照組相比，IGF-1 mRNA，NGF mRNA與β-actin光密度值之比明顯降低(P<0.01)。六味地黃丸高劑量組和糖末寧組與模型組相比，IGF-1 mRNA、NGF mRNA與β-actin光密度值之比明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組坐骨神經(jīng)NGF、IGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

T2DM患者慢性并發(fā)癥以DPN最常見。DPN的發(fā)病機(jī)制不明，存在多種假說。目前認(rèn)為主要與高血糖引起的代謝紊亂、微血管病變、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，然而無(wú)論是何種致病因素, 最終的結(jié)果都是引起神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的變性和壞死, 出現(xiàn)周圍神經(jīng)修復(fù)再生的障礙〔3〕。其基本病理改變包括節(jié)段性脫髓鞘、軸突變性、神經(jīng)纖維缺失及神經(jīng)纖維再生遲滯等。神經(jīng)病變可累及感覺神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及自主神經(jīng), 產(chǎn)生疼痛、麻木、運(yùn)動(dòng)障礙及自主神經(jīng)功能障礙〔4〕。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子, 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育、分化及再生有重要的生物學(xué)意義〔5，6〕。NGF由自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)的靶器官合成, 并經(jīng)神經(jīng)軸突逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元胞體, 在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長(zhǎng)遞質(zhì)的合成及細(xì)胞的凋亡等階段均起著重要作用，目前的研究顯示NGF參與DPN的發(fā)生與發(fā)展,并正逐步證實(shí)神經(jīng)組織修復(fù)再生能力受損與局部NGF合成分泌減少以及沿軸突逆行運(yùn)輸能力下降直接相關(guān)。IGF-1是另一種NGF, 已有研究表明神經(jīng)自分泌或旁分泌組織IGF-1基因下調(diào), 可能參與了DPN 的發(fā)生〔7〕。

被譽(yù)為“補(bǔ)陰方藥之祖”的六味地黃丸，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓6味中藥組成，其治療糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的臨床應(yīng)用已有悠久的歷史，薛江博〔8〕、段曉麗〔9〕也發(fā)現(xiàn)六味地黃丸對(duì)DPN患者有較好療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示T2DM大鼠模型復(fù)制成功。高劑量六味地黃丸能降低大鼠血糖水平從而改善糖尿病癥狀，減輕神經(jīng)組織損傷；同時(shí)還可明顯提高大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF及IGF-1 mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)病變神經(jīng)組織的修復(fù)，一定程度改善臨床DPN患者的癥狀。六味地黃丸治療DPN的機(jī)制與降低血糖水平、增加局部IGF-1的分泌有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

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2黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算〔J〕.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004;9(9):1069-72.

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8薛江博. 六味地黃聯(lián)合黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床研究〔J〕. 中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2010;17(33):101,136.

9段曉麗.六味地黃丸的藥理作用與臨床應(yīng)用〔J〕.山西醫(yī)藥雜志，2009;38(12):1156.