吳翊馨 張海平 高 巖 蘇勝林

(沈陽體育學(xué)院，遼寧 沈陽 110102)

隨著細胞骨架波形蛋白(Vimentin)在1978年從細胞中發(fā)現(xiàn)以來，其在肌肉病理研究等領(lǐng)域中的應(yīng)用價值逐漸被人們所認識〔1〕。越來越多的肌肉病理專家認為，了解并掌握細胞骨架蛋白特別是 Vimentin在損傷肌肉再生過程中的表達是深刻理解肌肉損傷病理機制的一個重要環(huán)節(jié)。維生素E(VE)作為一種抗氧化劑，具有清除自由基的功效，可減輕運動中抗氧化酶所受的自由基損傷，進而提高運動能力。本文探討VE對骨骼肌 Vimentin表達的影響，為骨骼肌損傷的防治與康復(fù)等提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與分組 雄性SD大鼠16只，體重(304±12)g，隨機分為安靜對照組(con)、運動后24 h組(24 h)、VE對照組(VEcon)、VE運動后24 h組(VE 24 h)，每組4只，組間動物體重?zé)o顯著性差異。VE 24 h組藥物注射采用腹腔注射方法，VE注射量為1～1.2 mg/kg，注射液體總量為4 ml/kg，初次注射時間為鼠正式實驗前1 h，以后每8 h注射1次，直至處死；VEcon組以生理鹽水為對照，注射方式、注射量及運動方式、處死時間同VE 24 h組。

1.2運動方式 用一次性下坡跑運動訓(xùn)練建立運動損傷模型。正式實驗前2 d，所有動物進行5～10 min跑臺運動，以熟悉跑臺，速度為5～10 m/min，坡度為0。正式實驗時，所有運動組動物均進行持續(xù)性下坡跑，速度為16 m/min，坡度為-16，總運動時間為200 min，100 min運動結(jié)束后，動物休息5 min，然后再進行100 min運動。運動結(jié)束后，將動物放回籠中，同樣條件飼養(yǎng)，直到處死。

1.3取材及處理 運動結(jié)束后，各組按不同時間點，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉動物，麻醉劑量為0.25～0.5 g/kg。迅速取出同側(cè)肱三頭肌，剔除筋膜等結(jié)締組織，冰冷生理鹽水清洗，并迅速置于10%甲醛鈣固定液中固定。

1.4骨骼肌Vimentin免疫組化切片制作與分析 Vimentin免疫組化試劑盒采用武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，嚴格按照試劑盒程序進行免疫組化切片制作。每組骨骼肌組織標本每種抗體染色切片各取6張，每張切片按對角線劃分區(qū)域任選取5個視野，顯微鏡下觀察(×400)，并用 Motic Image 3.0分析軟件對視野進行分析。參數(shù)設(shè)定：(1)目標總面積占圖像視場的百分比(%)=(目標總面積÷視野區(qū)域面積)×100%，反映Vimentin的相對含量；(2)灰度總和：視野區(qū)域面積內(nèi)Vimentin的總含量，反映染色強度。

2 結(jié) 果

與con組相比，VEcon組和24 h組大鼠骨骼肌vimentin目標面積百分比均有明顯增加，分別con組的116.23%和118.46%(P<0.01)，VEcon組和24 h組兩組間結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)；與VEcon組和24 h組相比，VE 24 h組目標面積百分比有所增加，分別為VEcon組和24 h組的109.20%和107.15%，但無顯著性差異(P>0.05)；與con組相比，VE 24 h組有顯著性增加(P<0.01)。見表1。

灰度總和的變化與目標面積百分比的變化類似，VEcon組和24 h組有顯著性增加(P<0.01)，分別為con組的153.40%和153.12%；與VEcon組和24 h組相比，VE 24 h組灰度總和亦有所增加，分別為VEcon組和24 h組的107.56%和107.76%，但無顯著性差異(P>0.05)；VE 24 h組比con組顯著性增加，為安靜對照組的165.01%(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠離心運動前后不同時刻骨骼肌vimentin形態(tài)測量結(jié)果

3 討 論

Vimentin是近年來有關(guān)骨骼肌損傷與恢復(fù)研究中的一個熱點〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，運動會引起骨骼肌細胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Bornemann等〔3〕采用向比目魚肌中注射熱的林格氏液，發(fā)現(xiàn)肌母細胞和幼稚的肌管細胞都有 Desmin和 Vimentin的表達，且隨著肌細胞的成熟，這兩種蛋白的表達均有降低，分布也由原先的散在轉(zhuǎn)為固定在Z板水平；Vimentin在傷后2～4 w，在肌纖維中消失，而 Desmin仍然存在，故認為 Vimentin是觀察肌肉再生的一個最好指標。

人體運動時需要更多的能量，機體對氧的攝取和消耗都會增加，體內(nèi)自由基也將成比例增加。在自由基增加的同時，大強度運動也消耗機體的抗氧化物質(zhì)，從而降低機體的抗氧化能力。急性運動可誘發(fā)內(nèi)源性自由基產(chǎn)生增加和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，造成對生物膜結(jié)構(gòu)的損傷，這可能與運動性損傷和疲勞的形成有關(guān)。運動可通過多種代謝途徑使機體組織中自由基生成增多〔4〕，同時自由基清除能力相對減弱〔5〕，使自由基在組織中積累，引起與疲勞發(fā)生有一定關(guān)系的生物膜結(jié)構(gòu)變化，甚至組織損傷。VE有許多功效，其最突出的化學(xué)性質(zhì)是抗氧化作用，它能增強細胞的抗氧化作用，有利于維持各種細胞膜的完整性，參加整體的某些細胞組織多方面的代謝過程，保持膜結(jié)合酶的活力和受體等作用。VE作為細胞膜內(nèi)重要的抗氧化物和膜穩(wěn)定劑，在維持肌肉組織的正常結(jié)構(gòu)和代謝，特別是在肌肉收縮期間的能量供給和Ca2+攝取和釋放有著重要的作用。余斌等〔6〕報道，口服VE可顯著提高大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低脂質(zhì)過氧化水平和線粒體游離鈣濃度，提高線粒體膜穩(wěn)定系數(shù)。VE保護大鼠線粒體膜穩(wěn)定性的原因可能是增強線粒體SOD活性，消除了更多的自由基，減少了運動中的氧化應(yīng)激，從而減輕了脂質(zhì)過氧化；脂質(zhì)過氧化作用的減弱使線粒體膜更加穩(wěn)定，抑制了骨骼肌線粒體游離鈣的聚積，進一步抑制脂質(zhì)過氧化作用。國內(nèi)外一些學(xué)者認為，VE的抗氧化作用抑制了運動中自由基的生成而間接保護了細胞膜的穩(wěn)定性，從而減少了Ca2+的內(nèi)流。國外一些學(xué)者認為，VE的衍生物普遍參與了質(zhì)膜的組成，VE可增強肌細胞膜、線粒體膜和肌漿網(wǎng)膜的完整性、穩(wěn)定性，防止肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的大量溢出引發(fā)骨骼肌的損傷〔7〕。

在本研究中，骨架蛋白免疫切片的圖像分析所示的目標總面積占圖像視場的百分比和灰度總和，反映的是 Vimentin的相對含量，間接的代表骨骼肌細胞 Vimentin的表達，其含量的升高和降低反映損傷的骨骼肌在不同的病理階段 Vimentin表達程度的變化，可作為反映了肌肉損傷和再生變化情況的量化指標。本研究結(jié)果表明，補充VE能有效地減少離心運動所引起的骨骼肌肌纖維損傷的形態(tài)學(xué)改變。

一般認為，VE具有抗氧化作用，同時也能促進蛋白質(zhì)的合成等功能〔8〕。李世成等〔9〕通過補充大豆對細胞骨架蛋白影響的角度來研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高強度離心運動后出現(xiàn)結(jié)蛋白抗結(jié)蛋白抗體染色脫染的現(xiàn)象，其脫染細胞百分數(shù)以運動后12 h最高；而波形蛋白不同程度的抗波形蛋白抗體染色陽性的現(xiàn)象，其陽性細胞百分數(shù)以運動后24 h最高；而補充大豆分離蛋白可減輕骨骼肌細胞抗結(jié)蛋白染色脫染的現(xiàn)象，并增加 Vimentin的表達，說明大豆蛋白可維持結(jié)蛋白的完整性，減輕運動性骨骼肌微細損傷。大豆蛋白含有活性肽，與VE同屬抗氧化劑，其減輕運動性骨骼肌損傷的作用應(yīng)該是一致的。本研究的VE能有效地減少骨骼肌肌纖維損傷形態(tài)學(xué)改變的結(jié)果，可能緣于VE的抗氧化和促進蛋白質(zhì)合成的功能，而后者還需進一步的研究加以確認。

4 參考文獻

1馬 濤，李世昌.細胞骨架及運動性骨骼肌微損傷研究進展〔J〕.體育學(xué)刊，2006;13(5)：48-52.

2段立公，李國平，李肅反.結(jié)蛋白和波形蛋白在運動性肌肉損傷和再生過程中表達及意義的實驗研究〔J〕.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2001;20(2)：167-70.

3Bornemann A，Schrnalbruch H.Desmin and vimentin in regenerating muscles〔J〕.Muscle Nerve,1992;15(1)：14-20.

4曹國華,陳吉棣.運動、營養(yǎng)與自由基代謝:游泳對小鼠肝臟組織內(nèi)自由基代謝的影響〔J〕.中國運動醫(yī)學(xué)雜志,1990;9(3):149-51.

5Higuchi M,Cartier LJ,Chen M,etal.Superoxide dismutase and catalase in skeletal muscle adaptive response to exercise〔J〕.J Gerontol,1985;40(3):281-6.

6余 斌，覃承訶，羅吉偉，等.抗氧化維生素對大鼠運動能力的影響〔J〕.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003;23(9):892-4.

7Beaton LJ,Allan DA,Tarnopolsky MA,etal.Contraction-induced muscle damage is unaffected by vitamin E supplementation〔J〕.Med Sci Sports Exerc,2002;34(5):798-805.

8林文弢.運動生物化學(xué)〔M〕.北京:人民體育出版社，1999:39-43.

9李世成，焦海舟,王啟榮,等.補充大豆蛋白對大鼠離心運動后骨骼肌細胞骨架Desmin 和Vimentin 的影響〔J〕.西安體育學(xué)院學(xué)報，2006;23(5)：68-71.