韓玉杰 趙 松 楊 洋 劉東雷 吳 愷 潘麗紅 朱 礫

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

肺癌是目前世界惡性腫瘤死亡的主要原因，發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)〔1〕。化療是肺癌治療的一種重要手段〔2〕，但是目前肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性以及毒副作用仍為治療過(guò)程中一大難題。三肽基乙醛蛋白酶體抑制劑(MG132)(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)是一種常用的肽醛類(lèi)26S蛋白酶體抑制劑，它能夠抑制泛素-蛋白酶體通路〔3〕介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，如影響核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)和凋亡抑制蛋白等的降解過(guò)程，從而影響細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是一種潛在的抗腫瘤藥物〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聯(lián)合MG132和順鉑(DDP)作用于肺癌A549細(xì)胞，觀察A549細(xì)胞抑制率、凋亡情況以及凋亡相關(guān)蛋白NF-κB、caspase9表達(dá)情況。探討MG132和DDP聯(lián)合應(yīng)用調(diào)控A549細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為肺癌的生物化療提供了新的治療思路和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 肺癌A549細(xì)胞由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst33342熒光染料購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；DDP購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司。MG132購(gòu)于Calbiochem公司。胎牛血清購(gòu)于美國(guó)HyClone公司。無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)液(RPMI1640)、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購(gòu)買(mǎi)于北京索萊寶科技有限公司公司。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。兔抗人B-actin單抗、兔抗人caspase9多抗、兔抗人NF-κB多抗購(gòu)于Santa Crus公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和適度的培養(yǎng)箱。1次/d更換培養(yǎng)液，用胰蛋白酶液(含0.02%EDTA和0.25%胰酶)消化細(xì)胞傳代或?qū)嶒?yàn)操作。實(shí)驗(yàn)分組為不加藥物干預(yù)的對(duì)照組、MG132組、DDP組、MG132與DDP聯(lián)合組(同時(shí)加入MG132和DDP)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml濃度接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入一系列濃度的DDP及MG-132，100 μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，藥物分別干預(yù)24、48、72 h后每孔加入5 g/L的MTT 10 μl，于37℃、5%CO2飽和適度的培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μl，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞抑制率=〔1-實(shí)驗(yàn)組A450/對(duì)照組A490〕×100%，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化 用胰蛋白酶液處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，制成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)濃度的MG132、DDP、聯(lián)合組作用細(xì)胞24 h，棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加入終濃度1 mg/L的Hoechst33342避光染色，37℃孵育20 min棄染液，PBS沖洗2次，然后置于倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并攝片，計(jì)算熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)(FCW)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化制成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)濃度的MG132、DDP、聯(lián)合組作用細(xì)胞24 h，收集懸浮及貼壁細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入400 μl Annexin結(jié)合液懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/ml，細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin-FITC，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI，4℃避光孵育5 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，每孔2×105個(gè)/ml接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)濃度的MG132、DDP、聯(lián)合組加入，培養(yǎng)24 h后收集懸浮及貼壁細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，將等量的蛋白以12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，再加入一抗caspase9、NF-κB及B-actin(抗體稀釋濃度為1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，于硝酸纖維素膜上滴加化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，結(jié)果用圖像處理儀(Gene Company)掃描，Image J軟件分析條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)藥物最適濃度和作用時(shí)間 隨著MG132和DDP的濃度和作用時(shí)間增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，呈濃度及時(shí)間依賴性。當(dāng)MG132作用24 h時(shí)，IC50約為30 μmol/L；當(dāng)DDP作用24 h時(shí)，IC50約為20 mg/L，因此本實(shí)驗(yàn)中MG132和DDP最適濃度分別為5 μmol/L和2.5 mg/L。

2.2Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化 Hoechst33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst33342比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，并且凋亡細(xì)胞的染色體DNA結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。MG132組和DDP組，細(xì)胞核裂解，染色質(zhì)凝集，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡，Hoechst33342染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為(15.2±0.1)%、(12.1±0.3)%。MG132與DDP聯(lián)合組陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(33.5±1.3)%，與單用藥組相比細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 對(duì)照組、MG132組、DDP組及MG132+DDP組caspase9和NF-κB蛋白相對(duì)灰度值分別為0.37±0.12、0.46±0.04、0.49±0.07、0.72±0.14和0.75±0.08、0.53±0.02、0.59±0.07、0.34±0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。MG132與DDP聯(lián)合組干預(yù)24 h后caspase9表達(dá)明顯增高，與單用藥組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩藥聯(lián)合干預(yù)24 h后，與單用藥組相比，NF-κB表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

圖2 Western印跡檢測(cè)Bax和NF-κB蛋白的表達(dá)情況

2.4FCW檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MG132組細(xì)胞凋亡率為(22.13±0.36)%，與對(duì)照組(3.1±0.3)% 相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DDP組細(xì)胞凋亡率為(25.76±0.25)%，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MG132與DDP聯(lián)合組細(xì)胞凋亡明顯增加，為(68.27±0.31)%，與MG132組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 MG132和DDP作用24 h后細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

肺癌發(fā)病率居惡性腫瘤首位，其中約80%為非小細(xì)胞肺癌。但是由于多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者就診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，因此化療就成為主要的治療方法之一〔5〕。鉑類(lèi)藥物(DDP、卡鉑)是肺癌一線化療方案的基礎(chǔ)，DDP的主要作用靶點(diǎn)是DNA，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細(xì)胞DNA形成DDP-DNA加合物，干擾細(xì)胞DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致DNA錯(cuò)配并誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔6〕。然而單用DDP易引起腫瘤的多種耐藥性，且其毒副作用較大，腫瘤的耐藥性一直是臨床化療難以克服的障礙〔7〕。因此，尋找新的毒副作用小耐藥性小抗腫瘤作用靶點(diǎn)已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

泛素蛋白酶體通路(UPP)是真核細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，阻斷UPP可以提高凋亡信號(hào)的活性從而促使一些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔8〕。蛋白酶體抑制劑可以通過(guò)阻斷蛋白酶體途徑進(jìn)而誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，是一種非常有發(fā)展前途的抗腫瘤作用靶點(diǎn)〔9〕。目前，蛋白酶體抑制劑硼替佐米已被美國(guó)FDA認(rèn)證是治療多發(fā)性骨髓瘤的有效藥物，其作用機(jī)制主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡〔10〕。MG132是一種常見(jiàn)的醛基肽類(lèi)特異性蛋白酶體抑制劑，已有許多研究證明它可以誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、卵巢癌、惡性血液病等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡〔9〕。MG132通過(guò)抑制蛋白酶體的活性，進(jìn)而抑制NF-κB的降解，阻止NF-κB釋放，抑制NF-κB啟動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡蛋白水平降低，使細(xì)胞色素C容易與Apaf-1結(jié)合形成“凋亡小體”，激活caspase-9從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔11〕。NF-κB是一種抑制細(xì)胞凋亡因子，調(diào)控多種免疫、炎癥反應(yīng)，在腫瘤的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和放化療抵抗方面也起到重要的作用〔12〕。本研究提示，MG132與DDP聯(lián)合作用促凋亡作用明顯提高，其部分作用機(jī)制可能是蛋白酶體抑制劑MG132抑制DDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中NF-κB的釋放，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)凋亡的敏感性，進(jìn)一步增強(qiáng)下游凋亡相關(guān)蛋白caspase9的活化以及表達(dá)。

綜上，MG132與DDP聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高肺癌A549細(xì)胞凋亡率，并探討其部分作用機(jī)制。這一研究成果，為臨床上蛋白酶體抑制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相信隨著人們今后對(duì)蛋白酶體抑制劑的進(jìn)一步研究，其在腫瘤的治療過(guò)程中的作用機(jī)制也將得到明確。雖然本研究的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，但是是否能有效地應(yīng)用于臨床治療中，還需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)加以考證。

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