鄧 娟 孫 娟 李 偉

(徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221002)

胰島β細(xì)胞分泌缺陷和胰島素抵抗(IR)是糖尿病的重要病理生理基礎(chǔ)，目前β細(xì)胞功能缺陷的機(jī)制尚未完全闡明。脂聯(lián)素是新近發(fā)現(xiàn)的脂肪組織特異分泌的一個具有重要功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善IR、抗炎及抗動脈粥樣硬化等作用〔1，2〕，在延緩2型糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。然而，脂聯(lián)素對胰島細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究檢測脂聯(lián)素對胰島β細(xì)胞分泌功能的影響，探討脂聯(lián)素與IR的關(guān)系，并對其具體的分子信號機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1材料 INS-1細(xì)胞株購自上海拜力生物科技有限公司；胎牛血清，1640培養(yǎng)基 (美國Gibco公司)；重組大鼠球形APN(北京愛迪博)；大鼠胰島素測定ELISA試劑盒(北京愛迪博)；細(xì)胞裂解液、Western印跡用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白兔抗大鼠單克隆抗體(購自美國Cell Signaling公司)；ECL顯色試劑盒(上海申能博采公司)；IRS-1酪氨酸磷酸化抗體(美國Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞株生長于含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)液中(含β- 巰基乙醇5 μl/L，青、鏈霉素各100 U/ml，加1 mmol/L丙酮酸鈉，10 mmol/L HEPES 粉，)，置于含5% CO2濃度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，至70%～80%融合后分為兩組：對照組：予5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)，加入100 μg/L脂聯(lián)素(從10～1 000 μg /L的劑量曲線中選出)；高糖組：予25.6 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)，加入100 μg/L脂聯(lián)素。每3～4天用0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于實(shí)驗。

1.2.2實(shí)驗分組 實(shí)驗分為對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)，對照組+脂聯(lián)素組(5.5 mmol/L葡萄糖+100 μg/L脂聯(lián)素)，高糖組(25.6 mmol/L葡萄糖)，高糖+脂聯(lián)素組(25.6 mmol/L葡萄糖+100 μg/L脂聯(lián)素)，分別干預(yù)24 h，48 h，72 h。

1.2.3IR細(xì)胞模型的建立與分組 IR細(xì)胞模型建立參照文獻(xiàn)〔3，4〕。單層貼壁INS-1細(xì)胞用FFA(0.40 mmol/L)培養(yǎng)24 h后，于4 ℃條件下用預(yù)冷0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，即成為具有IR的細(xì)胞模型。鑒定模型成功后，加入脂聯(lián)素。分成組三組：正常組、IR模型組、脂聯(lián)素組。

1.2.4模型鑒定 取培養(yǎng)液采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，用Braford微量法測定蛋白濃度。培養(yǎng)液中葡萄糖含量=樣品吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值X標(biāo)準(zhǔn)品濃度(g/L)×1 L/g protein。細(xì)胞內(nèi)糖原含量測定：蒽酮法測定細(xì)胞內(nèi)糖原含量〔10-2×g/(g protein)〕，糖原含量=樣品吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)吸光度值×標(biāo)準(zhǔn)品糖原含量(10-2×g)/g protein。

1.2.5酶聯(lián)免疫法(ELISA) 采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按說明書操作，將各時間點(diǎn)收集得到細(xì)胞上清液在常溫下溶解，各取100 μl 分別加入已包被好胰島素抗體的ELISA 96孔板中。ELISA 間接夾心法檢測反應(yīng)終止后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的A值，根據(jù)胰島素標(biāo)準(zhǔn)品A值曲線，換算所測上清液中胰島素的含量。

1.2.6Western印跡檢測AMPK蛋白的表達(dá) ①收集細(xì)胞提取按照蛋白提取試劑盒(上海申能博采公司)的說明書操作；②Western印跡過程:依次灌制10% SDS-PAGE分離膠、5%聚合膠；轉(zhuǎn)膜；室溫下用TBS封閉液封閉1 h；于4 ℃將膜與一抗(AMPK 1∶1 000 )孵育過夜；TBS洗膜3次，每次30 min。將膜置于HRP 標(biāo)記的二抗(1∶2 000)稀釋液中，室溫振蕩孵育1 h。洗膜液洗膜3次，每次30 min。暗室里按照ECL說明書加入發(fā)光液，室溫輕搖1 min，注意避光。在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中，約1～5 min；將膠片依次放在顯影液、定影液中洗；水沖洗，可在相應(yīng)位置見到目的條帶β-actin為內(nèi)參。Western印跡檢測IRS-1酪氨酸蛋白表達(dá)：①提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取樣品蛋白質(zhì)2 mg加IRS-1抗體過夜后加入蛋白A瓊脂孵育3 h。洗滌免疫沉淀復(fù)合物后加入Laemmli上樣緩沖液煮沸5 min，6%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含3%BSA的TBST溶液+含(0.05%Tween20)37 ℃封膜1 h后，分別加入用封閉液稀釋的IRS-1抗體磷酸酪氨酸抗體4過夜。洗膜后加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖1 h，洗膜后用ECL顯像曝光，應(yīng)用光密度掃描儀測各條帶密度。

2 結(jié) 果

2.1脂聯(lián)素對胰島分泌功能的影響 在5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)濃度下，脂聯(lián)素處理組的胰島素分泌水平在不同的孵育時間與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)濃度相比較，在25.6 mmol/L濃度下，兩組的胰島素分泌水平均顯著升高，其中脂聯(lián)素處理組的胰島素分泌在培養(yǎng)48～72 h后均高于高糖組(P<0.05)。見表1。

2.2培養(yǎng)液中葡萄糖含量及細(xì)胞內(nèi)糖原含量變化 IR模型組培養(yǎng)液中葡萄糖含量明顯高于組，細(xì)胞內(nèi)糖原含量顯著減少(P均<0.05)，加入脂聯(lián)素組中培養(yǎng)液中葡萄糖含量較IR模型組顯著降低，細(xì)胞內(nèi)糖原含量升高(P均<0.01)。見表2。

2.3細(xì)胞中AMPK蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，IR模型組AMPK蛋白水平明顯降低；而脂聯(lián)素可對抗高糖高脂的影響，使AMPK蛋白水平增加，見圖1。

表1 在不同葡萄糖濃度下脂聯(lián)素對胰島細(xì)胞胰島素分泌的影響

表2 各組培養(yǎng)液中葡萄糖含量及細(xì)胞內(nèi)糖原含量

圖1 細(xì)胞中AMPK蛋白表達(dá)水平比較

2.4細(xì)胞中IRS-1酪磷酸化表達(dá)水平比較 與對照組比較，IR模型組IRS-1酪磷酸化水平明顯降低；而脂聯(lián)素可對抗高糖高脂的影響，使IRS-1酪磷酸化水平增加，見圖2。

圖2 細(xì)胞中IRS-酪磷酸化表達(dá)水平比較

3 討 論

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種重要的脂肪因子。也被稱為AdipoQ、GBP28或Acrp30。它由244個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為30×103。這一脂源性細(xì)胞因子可以顯著改善IR狀態(tài)，但其是否可以調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能，進(jìn)而影響糖尿病的發(fā)生，目前尚存爭論。

脂聯(lián)素可以改善IR并在一定條件下促進(jìn)胰島素的分泌。Gu等〔5〕發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素處理后的胰島細(xì)胞在低糖(3.3 mmol/L)培養(yǎng)2 h內(nèi)，其胰島素分泌被抑制；而在高糖(16.7 mmol/L)培養(yǎng)6～24 h，其胰島素分泌持續(xù)增加，提示指聯(lián)素在一定程度上是一種依賴于葡萄糖濃度的胰島素促泌劑。Okamoto等〔6〕發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠注射APN后可促進(jìn)胰島素分泌。王適龍等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素能促進(jìn)高糖環(huán)境下的胰島素分泌，其機(jī)制可能與通過下調(diào)PPARγ，降低UCP-2的表達(dá)有關(guān)。有研究表明，葡萄糖刺激的胰島素分泌的本質(zhì)是葡萄糖對AMPK的抑制〔8〕。脂聯(lián)素在外周的作用主要是通過AMPK介導(dǎo)〔9〕。脂聯(lián)素能夠激活骨骼肌細(xì)胞和肝細(xì)胞中的AMPK，刺激肝和肌肉中糖的利用和脂肪酸的β氧化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量的增加。但脂聯(lián)素在胰島細(xì)胞內(nèi)的作用方式至今尚無定論。業(yè)已證實(shí)，鼠β細(xì)胞中有1 型和2 型脂聯(lián)素受體的表達(dá)，并且在胰島素分泌性MIN6 細(xì)胞中也可檢測到這類受體的存在〔8〕。因此，da Silva Xavier等〔10〕提出假說，認(rèn)為脂聯(lián)素在胰島細(xì)胞中也有與外周相似的作用途徑。

IR是臨床許多疾病如糖尿病、肥胖、高血壓與動脈硬化等疾病的共同的危險因素與病理生理基礎(chǔ)。IR的研究涉及許多方面，目前許多研究是關(guān)于胰島素受體和受體后信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，尤其是胰島素信號鏈傳導(dǎo)障礙在IR中的作用日益引起人們的關(guān)注。

脂聯(lián)素是胰島素敏感性的一個重要的調(diào)控因子已有研究顯示，在糖尿病發(fā)生與發(fā)展過程中，血清脂聯(lián)素濃度的降低與體重增加、高胰島素血癥和IR呈平行關(guān)系〔11〕。有報道顯示2型糖尿病伴肥胖患者血清脂聯(lián)素濃度會下降，且血清脂聯(lián)素水平下降的程度與IR及高胰島素血癥具有一定的相關(guān)性〔12〕。

AMPK作為一種重要的蛋白激酶參與多種代謝過程，同時介導(dǎo)了細(xì)胞對營養(yǎng)和環(huán)境變化的適應(yīng)，被稱為“能量感受器”。脂聯(lián)素具有促進(jìn)糖脂代謝、減輕IR、抗炎以及抗動脈粥樣硬化等作用。Yamauchi等〔13〕在體內(nèi)和體外實(shí)驗均發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素刺激肌細(xì)胞中ACC 的磷酸化、脂肪酸的氧化、葡萄糖的攝取和乳酸鹽的生成都與AMPK的活化有關(guān)；當(dāng)AMPK活性被抑制時，脂聯(lián)素產(chǎn)生的這些效應(yīng)也均被抑制。這提示由脂聯(lián)素刺激的葡萄糖利用和脂肪酸氧化可能是通過AMPK的介導(dǎo)完成的。Kamon等〔14〕證實(shí)，在肌肉中脂聯(lián)素激活A(yù)MPK和過氧化物酶體增殖物活化受體γ，增加脂肪酸的β氧化，減少甘油三酯的含量，減輕肌肉中的IR；在肝臟，脂聯(lián)素同樣激活A(yù)MPK，下調(diào)葡萄糖-6-磷酸酶，減少肝臟葡萄糖的輸出。給IR大鼠模型注射一定劑量的AICAR ，可激活A(yù)MPK，通過胰島素信號通路提高機(jī)體的胰島素敏感度〔15〕。本實(shí)驗中可見脂聯(lián)素可顯著改善(FFA)誘導(dǎo)的IR細(xì)胞模型。另外，IR細(xì)胞模型組中AMPK表達(dá)減少，提示AMPK可能參與IR的形成。加入脂聯(lián)素組AMPK表達(dá)增加，推測脂聯(lián)素改善IR可能與提高AMPK蛋白的活性有關(guān)。

β細(xì)胞所表達(dá)的IRS家族主要包括IRS-1、IRS-2及IRS-3。IRS-1在整個胰島上廣泛分布。Yamauchi等〔13〕通過給嚴(yán)重IR的脂肪萎縮小鼠注射基因重組的脂聯(lián)素后發(fā)現(xiàn)，骨骼肌胰島素受體和Akt激酶磷酸化以及IRS-1酪氨酸磷酸化明顯增加。IRS主要通過PI-3K激活途徑發(fā)揮作用，是β細(xì)胞胰島素分泌的重要信號。動物實(shí)驗也證明，脂聯(lián)素基因敲除小鼠肌肉中PI-3K活性明顯降低，通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方法提高血漿脂聯(lián)素水平后可顯著提高肌肉中PI-3K的活性，其胰島素敏感性明顯增加。本研究結(jié)果提示IRS-1酪氨酸磷酸化異常參與了IR的形成。加入脂聯(lián)素組IRS-1酪氨酸磷酸化表達(dá)明顯升高，提示脂聯(lián)素改善IR可能與提高IRS-1酪氨酸磷酸化表達(dá)有關(guān)，但具體的磷酸化位點(diǎn)有待進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Ouchi N,Walsh K.Adiponectin as an anti-inflammatory factor〔J〕.Clin Chim Acta,2007；380(1/2):24-30.

2Lopez Bermejo A,Botas P,Funahashi T,etal.Adiponectin，hepatocellular dysfunction and insulin sensitivity 〔J〕.Clin Endocrinol,2004;60(2):256-63.

3趙 燕，郝衛(wèi)東.8-羥基-2'-脫氧鳥苷的生物學(xué)意義及其尿中含量的測定方法〔J〕.癌變·畸變·突變，2007；19(5)：418-20.

4Dedon PC,Tannenbaum SR.Reactive nitrogen species in the chemical biology of inflammation〔J〕.Arch Biochem Biophys,2004;423(1):12-22.

5Gu W,Li X,Liu C,etal.Globular adiponectin augments insulin secretion from pancreatic islet beta cells at high glucose concen-trations〔J〕.Endocrinology,2006;30(2):217-21.

6Okamoto M,Oharalmaizumi M,Kubota N,etal.Adiponectin induces insulin secretion in vitro and in vivo at a low glucose concentration〔J〕.Diabetologia,2008;51(5):827-35.

7王適龍，鐘 惠，菊盛杰，等.球形脂聯(lián)素對胰島β細(xì)胞胰島素分泌和凋亡的影響〔J〕.中國糖尿病雜志，2010；18(12)：931-3.

8Kharroubi I,Rasschaert J,Eizirik DL,etal.Expression of adiponectin receptors in pancreatic cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2003;312(4):1118-22.

9Yamauchi T,Kamon J,Minokoshi Y,etal.Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase〔J〕 .Nat Med,2002;8(11):1288-95.

10da Silva Xavier GS,Leclerc I,Salt IP,etal.Role of AMP-activated proten kinase in the regulation by glucose of islet beta cell gene expression〔J〕 .Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(8):4023-8.

11Minoru I,Eisuke M,Masao Y,etal.Correlation between the adiponectin-leptin ratio and parameters of insulin resistance in patients with type 2 diabetes〔J〕.Metab Clin Exp,2005;54(3):281-6.

12Lindsav RS,Funabashi T,Hanson RL,etal.Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pmia India population 〔J〕.Lancet,2002;360(9):57-8.

13Yamauchi T,Kamon J,Minokoshi Y,etal.Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase〔J〕.Nat Med,2002;8(11):1288-95.

14Kamon J,Yamauchi T,Terauchi Y,etal.The mechanisms by which PPAR gamma and adiponectin regulate glucose and lipid metabolism〔J〕.Nippon Yakutigaku Zasshi,2003;122:294-300.

15Wright DC,Geiger PC,Holloszy JO,etal.Contraction and hypoxia stimulated glucose transport is mediated by a Ca2+dependent mechanism in slow twitch rat soleus muscle 〔J〕 .Am J Physiol Endocrinol Metab,2005;288(6):1062-6.