何曉英 付 華 袁 平 譚 華 李小剛

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF) 是一種造血因子，最開始被用于治療粒細(xì)胞減少癥等血液系統(tǒng)疾病。研究證明G-CSF可通過血-腦脊液屏障在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的非造血作用。目前越來越多研究發(fā)現(xiàn)G-CSF治療缺血性腦腦卒中有多種生物活性，可通過不同病理生理途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。李健生等〔1〕報(bào)道G-CSF能通過動(dòng)員骨髓干細(xì)胞改善腦卒中后神經(jīng)功能受損癥狀；Sevimli等〔2〕、Sugiyama等〔3〕分別證實(shí)G-CSF在腦梗死模型中具有抗炎作用和抗凋亡作用；最近有研究表明，在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭蠫-CSF通過增強(qiáng)側(cè)支血管生長而改善腦血管的儲(chǔ)備能力〔4〕； Prasad 等〔5〕對(duì)急性期、England等〔6〕對(duì)亞急性期腦卒中的臨床試驗(yàn)研究中也證明，G-CSF不僅能夠減少梗死面積，而且具有較高的安全性。本研究從腦水腫程度、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9動(dòng)態(tài)表達(dá)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞活性變化角度，探討G-CSF對(duì)腦出血(ICH)大鼠的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供體重為250～320 g的SD大鼠96只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=24)、ICH組和治療組(n=36)，其中各組又按6、24、48、72 h、7、10 d時(shí)間點(diǎn)分為6個(gè)亞組(假手術(shù)組n=4，ICH組、治療組n=6)。

1.2ICH模型的制作〔7〕SD大鼠術(shù)前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射后，俯臥位固定在立體定位儀上，無菌操作暴露前囟，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，定位于前囟前0.2 mm、中線右側(cè)旁開3 mm、深6 mm為注血點(diǎn)，將非肝素抗凝斷尾獲取的動(dòng)脈血50 μl，先注入10 μl，停針2 min，后緩慢注入40 μl，注血時(shí)間約5 min，完畢后留針10～15 min，再緩慢退針。術(shù)后青霉素粉末涂抹局部，縫合皮膚。所用手術(shù)器械均經(jīng)高壓滅菌消毒，整個(gè)手術(shù)過程無菌操作。假手術(shù)組：參照上述方法，經(jīng)注入點(diǎn)注入等量無菌生理鹽水。治療組制模成功1 h后經(jīng)腹腔注射重組G-CSF(60 μg/kg)，假手術(shù)組、ICH組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。

1.3腦組織含水率測定 各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(假手術(shù)組n=2，ICH組、治療組n=3)麻醉后迅速斷頭取腦，將取出的腦組織放在用生理鹽水浸潤過的濾紙上，以防止水分蒸發(fā)。去除軟腦膜和血跡，精密稱濕重。將取出的腦組織在100℃烤箱內(nèi)烘烤24 h，再稱取干重。按Blliot公式計(jì)算腦組織含水率= (濕重-干重)/濕重×100%。

1.4MMP-9、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)測定 各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(假手術(shù)組n=2，ICH組、治療組n=3)麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛，取出腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明進(jìn)行染色。采集系統(tǒng)對(duì)MMP-9、GFAP的表達(dá)測定采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每只大鼠選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機(jī)選取血腫周圍的 4 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。MMP-9陽性表達(dá)為細(xì)胞膜及胞質(zhì)呈棕褐色，GFAP陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)及星狀突起纖維呈黃色或黃棕色。

2 結(jié) 果

2.1各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織含水率動(dòng)態(tài)變化 ICH組腦組織含水率各時(shí)間點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，6 h開始增高，24 h進(jìn)一步升高，48～72 h達(dá)到最高峰。治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水率明顯低于ICH組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血腫周圍組織MMP-9動(dòng)態(tài)變化 ICH組各時(shí)點(diǎn)MMP-9表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，6 h少量散在表達(dá)，24 h開始增多，48～72 h達(dá)高峰，10 d仍有少量表達(dá)。治療組各時(shí)點(diǎn)MMP-9表達(dá)顯著低于ICH組(P<0.05)，6 h較少表達(dá)，同樣在24 h開始迅速增多，48～72 h達(dá)高峰，后逐漸下降。見表2。

2.3腦組織含水率與MMP-9相關(guān)性分析 假手術(shù)組腦組織含水率與MMP-9表達(dá)無相關(guān)性(r=0.429,P=0.396 1)；ICH組腦組織含水率與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.922,P=0.008 9)；治療組腦組織含水率與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.844，P=0.034 5)。

2.4各組大鼠血腫周圍組織GFAP測定 假手術(shù)組未見GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)。ICH組6 h即有少量GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，分布稀疏、著色較淺、胞體體積較小、突起分支較少；48 h開始增多；72 h出現(xiàn)大量表達(dá)；7 d GFAP達(dá)高峰，胞體肥大、突起增粗且增長、著色較深，與組內(nèi)其他時(shí)點(diǎn)比較差異顯著(P<0.05)；10 d GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)減少。治療組6h GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)與ICH組相似，24 h、48 h、72 h、7 d、10 d表達(dá)較ICH組明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞變形程度減輕。見表3。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水率比較

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍MMP-9表達(dá)(個(gè)/單位面積，

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)血腫周圍GFAP表達(dá)(個(gè)/單位面積，

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)表明，在缺血性腦血管病中使用G-CSF干預(yù)的生存率及神經(jīng)功能評(píng)分均高于對(duì)照組，這提示G-CSF在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)方面起著一定的生理作用，故在尨經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注。關(guān)于G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑，初期學(xué)者們推測可能是G-CSF動(dòng)員了BMSC，促進(jìn)前腦的神經(jīng)干細(xì)胞分化并從側(cè)腦室向損傷區(qū)募集神經(jīng)前體細(xì)胞來促進(jìn)神經(jīng)功能的重建。隨著研究的深入，Schabitz等〔8〕在離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在受到刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞上有G-CSF表達(dá)，Schneider 等〔9〕發(fā)現(xiàn)體內(nèi)正常腦組織神經(jīng)元上也有 G-CSF表達(dá)，并且應(yīng)用免疫組化、western Blot和RT-PCR法均證實(shí)鼠腦的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞有G-CSF受體(G-CSF-R)存在。在此基礎(chǔ)上，Hasselblatt等〔10〕試驗(yàn)證實(shí)G-CSF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過與效應(yīng)細(xì)胞表面特異性G-CSF-R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。腦組織存在內(nèi)源性G-CSF，腦損傷后機(jī)體啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制通過上述途徑使神經(jīng)環(huán)路和功能得到部分重建。Solaroglu等〔11〕采用不能透過血腦屏障的碘化牛血清白蛋白作為對(duì)照，給大鼠注射碘化的G-CSF，計(jì)算注射后1 h，4 h，24 h 碘化G-CSF和碘化白蛋白的腦/血清比值，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G-CSF顯示一個(gè)較高的腦/血清比值，證實(shí)G-CSF能夠通過完整的血腦屏障，為外源性G-CSF治療中樞系統(tǒng)疾病提供了科學(xué)的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

腦水腫是ICH最為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷，是導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)改變和功能損傷的重要原因之一，有效減輕腦水腫是ICH的治療關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠自體血ICH模型，結(jié)果說明G-CSF減輕了ICH后的腦水腫。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了G-CSF減輕腦水腫程度的可能機(jī)制。MMP-9是影響腦水腫發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。Gursoy等〔12〕對(duì)基因遺傳工程小鼠的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MMP-9能夠改變血腦屏障通透性并加重腦水腫。應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)臨床患者的觀察發(fā)現(xiàn)ICH患者腦水腫消長規(guī)律與血清MMP-9變化一致〔13〕。本實(shí)驗(yàn)也說明ICH后MMP-9表達(dá)增強(qiáng)并參與了ICH后腦水腫形成。治療組各時(shí)點(diǎn)MMP-9表達(dá)明顯輕于ICH組，提示G-CSF抑制了MMP-9的表達(dá)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)治療組MMP-9表達(dá)和腦組織含水率也成正相關(guān)關(guān)系。因此，G-CSF可能通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)減輕了ICH后腦水腫，其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

GFAP為僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)中的單體中間絲蛋白，是細(xì)胞骨架的主要組成部分，通常情況下正常Ast的GFAP表達(dá)量不高，中樞神經(jīng)損傷后GFAP 在Ast中有豐富而特異性的表達(dá)，是Ast活化的客觀標(biāo)志蛋白〔14〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，Ast由常態(tài)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性Ast，稱之為Ast活化，表現(xiàn)為Ast數(shù)量上增加，細(xì)胞胞體、胞核大小及突起長度的變化〔15〕。活化的Ast在腦損害后有利弊雙向作用：一方面，Ast活化，對(duì)細(xì)胞間隙的谷氨酸及H+、K+等清除能力增加可增強(qiáng)能量代謝能力；釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子增多，有助于受損神經(jīng)元的修復(fù)；合成大量的載脂蛋白E重建神經(jīng)元完整性，增加突觸聯(lián)系，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)及功能重建〔16〕。另一方面，活化的Ast可產(chǎn)生大量NO，通過對(duì)大分子特別是DNA的修飾，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死；可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎性反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞壞死，引起血腦屏障開放，參與腦水腫病理過程；過度的膠質(zhì)化也可以作為機(jī)械屏障妨礙髓鞘和軸索的再生，影響周圍神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)〔17〕。 因此，活化的Ast對(duì)ICH后神經(jīng)組織是一把雙刃劍，依靠神經(jīng)系統(tǒng)代償性的自我調(diào)節(jié)不足以既發(fā)揮Ast的神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)又抑制Ast神經(jīng)毒性作用，可能是導(dǎo)致ICH預(yù)后不佳的因素之一。因此，Ast在ICH中適度活化無疑具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)觀察到假手術(shù)組無GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，表明Ast處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；ICH組6 h開始GFAP少許表達(dá)，隨時(shí)間延長逐漸增多，72 h大量表達(dá)，7 d達(dá)高峰，該規(guī)律與已有研究報(bào)道基本一致〔18〕；實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示G-CSF下調(diào)了ICH后GFAP表達(dá)，抑制Ast過度活化。理論上G-CSF抑制了ICH大鼠Ast過度膠質(zhì)化，可增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，而減輕對(duì)腦組織的損傷作用，但是怎樣才能使GFAP恰好維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃綇亩畲蟪潭劝l(fā)揮Ast的神經(jīng)保護(hù)作用以及G-CSF抑制Ast過度活化的確切機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

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