任鵬濤 張 苑 閆慶輝 張國(guó)建 林 林 趙 晶

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肛腸外科，河北 石家莊 050000)

目前腫瘤的治療手段多種多樣，其中腫瘤的生物治療已成為手術(shù)、放療、化療三大常規(guī)模式的有益補(bǔ)充〔1〕。生物治療中的過(guò)繼性細(xì)胞免疫療法(ACI)是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的〔2〕。近期研究發(fā)現(xiàn)去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)中自然發(fā)生的Treg(nTreg)細(xì)胞可以提高機(jī)體的抗腫瘤作用，所以尋找既能增強(qiáng)效應(yīng)性免疫細(xì)胞抗腫瘤作用又能抑制Treg細(xì)胞作用的方法，將成為改善免疫治療的新策略。本文以樹(shù)突細(xì)胞(DC)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK)疫苗治療黑色素細(xì)胞瘤小鼠，探討該疫苗對(duì)荷瘤小鼠nTreg的影響，評(píng)價(jià)nTreg在DC和CIK細(xì)胞疫苗治療中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立 體外培養(yǎng)黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞株，將黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞注入C57 BL/6小鼠的皮下，制備小鼠的黑色素瘤動(dòng)物模型。

1.2DC和CIK細(xì)胞疫苗 無(wú)菌狀態(tài)下采集C57BL/6小鼠脾臟，碾碎后制備脾臟細(xì)胞懸液并按照文獻(xiàn)〔3〕制備DC，在1640培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)2 h，并用RPMI1640培養(yǎng)液清洗2次，然后加入1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16 h，收集非貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞。培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞，超聲破碎后經(jīng)12 000 r/min離心，取上清用0.22 μm過(guò)濾除菌，配置成1 000 ng/ml的蛋白液，按照1∶1體積與上述制備的DC細(xì)胞混合，37度孵育4 h備用。將DC濃度調(diào)整至105/L，同時(shí)加入相同體積的109/L T淋巴細(xì)胞，并且加入白細(xì)胞介素(IL)-2 5×105U/L，培養(yǎng)7 d后收獲后即位CIK細(xì)胞，具有可殺傷腫瘤細(xì)胞活性。按照如下操作制備CIK細(xì)胞： 第1組：將小鼠脾臟細(xì)胞懸液應(yīng)用免疫磁株分選的方法，去除nTreg細(xì)胞后，再用已制備的黑色素細(xì)胞瘤特異性DC疫苗進(jìn)行共培養(yǎng)，制備腫瘤特異性的CIK效應(yīng)細(xì)胞。第2組：未刪除Treg細(xì)胞的T細(xì)胞，直接應(yīng)用DC誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞形成腫瘤特異性的CIK效應(yīng)細(xì)胞。第3組：未刪除Treg細(xì)胞的T細(xì)胞，直接應(yīng)用DC誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞形成腫瘤特異性的CIK效應(yīng)細(xì)胞后，再應(yīng)用免疫磁株分選的方法，去除Treg細(xì)胞。

1.3治療方法 將負(fù)荷第一步建立的黑色素瘤C57BL/6小鼠的動(dòng)物模型，應(yīng)用Co60照射達(dá)到非髓性淋巴細(xì)胞刪除(NMLD)狀態(tài)。于體內(nèi)低淋巴細(xì)胞血癥的選定狀態(tài)下回輸DC疫苗以及第三步制備的效應(yīng)細(xì)胞到C57BL/6荷瘤小鼠體內(nèi)。分成治療A組(輸入刪除nTreg的DC和CIK疫苗)、治療B組(輸入未刪除nTreg的DC和CIK疫苗)、治療C組(輸入DC和CIK疫苗制備好后刪除nTreg的疫苗)和對(duì)照組(造模且輸入生理鹽水)各10只，并以10只未造模的小鼠為空白組(不造模且輸入生理鹽水)。

1.4評(píng)價(jià)方法

1.4.1體外腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn) 取培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，根據(jù)腫瘤細(xì)胞濃度，按照20∶1的數(shù)量比加入100 μl三種方法制備的CIK細(xì)胞，另外設(shè)置單獨(dú)CIK細(xì)胞和單獨(dú)腫瘤細(xì)胞孔，每孔3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。吸去上層100 μl液體，加入20 μl 0.5%的四甲基噻唑藍(lán)混勻后，37℃孵育4 h后，加入100 μl二甲基亞砜，混勻、震蕩，室溫放置10 min后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)492 nm，參考波長(zhǎng)為650 nm。根據(jù)殺傷活性(%)=〔(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值)/單獨(dú)腫瘤細(xì)胞組吸光值〕×100% 計(jì)算各組的CIK的殺傷活性。

1.4.2腫瘤大小測(cè)量 用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑，按公式(長(zhǎng)徑乘以短徑的平方)除以2作為評(píng)價(jià)腫瘤大小的指標(biāo)。分別測(cè)量治療1、3、6、8、12 d時(shí)小鼠腫瘤大小。

1.4.3小鼠生存情況 分別統(tǒng)計(jì)各組大鼠在30 d內(nèi)的生存情況，繪制生存曲線。

1.4.4細(xì)胞因子檢測(cè) 分別在治療前和治療后3、8 d對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾取血，取出的血液首先經(jīng)過(guò)37℃孵育，使其充分血凝，然后2 500 r/min離心20 min，取上清，進(jìn)行IL-2和IFN-γ檢測(cè)。所有試劑盒為：鼠IL-2 ELISA Kit(GenStar,C702-01);鼠IFN-γ ELISA Kit ( Genstar,C707-01 )。

2 結(jié) 果

2.1體外殺傷結(jié)果 第1組制備的DC和CIK疫苗殺傷黑色素瘤細(xì)胞活性最強(qiáng)，平均殺傷活性為(98.32±6.24)%，顯著高于第2組(45.53±9.13)%和第3組(51.27±8.24)%(t=8.22 ,P=0.004;t=7.88,P=0.004)。

2.2五組治療后腫瘤大小變化情況 對(duì)照組小鼠腫瘤體積顯著升高，治療B和C組在第8、12天腫瘤生長(zhǎng)被抑制，治療A組在第6天腫瘤被抑制，第8、12天腫瘤大小顯著降低。見(jiàn)圖1。

圖1 腫瘤大小變化情況(mm)

2.3各組生存情況 對(duì)照組小鼠在30 d內(nèi)全部死亡，治療A組僅在第3、6天分別死亡1只，治療B組30 d內(nèi)有5只存活，治療C組30 d有3只存活，均顯著高于對(duì)照組(χ2=1.327,P=0.001；χ2=21.214,P=0.031；χ2=16.193,P=0.024)。見(jiàn)圖2。

圖2 五組小鼠生存情況

3 討 論

本研究結(jié)果說(shuō)明nTreg會(huì)抑制 DC和CIK疫苗殺傷腫瘤細(xì)胞活性以及治療腫瘤療效。近幾年，有關(guān)Treg在免疫系統(tǒng)中的作用一直是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)課題。研究發(fā)現(xiàn)將去除了Treg細(xì)胞成分的T細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)會(huì)引發(fā)多種的自身免疫性疾病，但如果注入Treg細(xì)胞卻可以抑制這些疾病的發(fā)生；體外研究也證實(shí)Treg具有免疫抑制功能。隨著人們對(duì)Treg細(xì)胞研究的深入發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞數(shù)量升高且具有抑制腫瘤免疫的效應(yīng)，這對(duì)于腫瘤疫苗的發(fā)展是一個(gè)重要障礙。CIK就是其中一種新型的免疫活性細(xì)胞，它是將外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點(diǎn)，從而成為ACI過(guò)程中的研究熱點(diǎn)。但在實(shí)踐中許多腫瘤免疫治療方法僅能誘導(dǎo)微弱且短暫的免疫應(yīng)答，不能產(chǎn)生長(zhǎng)期、有效的抗腫瘤治療作用。有關(guān)DC和CIK細(xì)胞疫苗療效的報(bào)道很多，且已經(jīng)應(yīng)用于臨床。陳海飛等〔4〕用DC-CIK細(xì)胞疫苗治療34例晚期非小細(xì)胞癌患者，可緩解癌癥進(jìn)展，控制率為67.6%。侯彩妍等〔5〕探討了DC-CIK疫苗的安全性，僅有部分患者出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)。夏禾愛(ài)等〔6〕的結(jié)果也表明DC-CIK疫苗可逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤患者免疫抵御能力，從而達(dá)到一定的療效，郭杰等〔7〕也在直腸癌化療治療中應(yīng)用DC-CIK。

劉愛(ài)華等〔8〕研究了Tregs對(duì)DC-CIK治療移植瘤胃癌活性的影響，結(jié)果得出刪除CD4(+)CD25(+)Treg制備的DC-CIK細(xì)胞疫苗抗腫瘤活性會(huì)顯著高于未刪除CD4(+)CD25(+)Treg制備的DC-CIK細(xì)胞疫苗的活性。本文的結(jié)果與劉愛(ài)華的結(jié)果一致，從體外殺傷、抑制腫瘤大小和小鼠生存情況三個(gè)方面評(píng)價(jià)。雖然如此，文章未評(píng)價(jià)哪種類型的Treg發(fā)揮作用，究竟是nTreg還是活化后的Treg發(fā)揮抑制作用以及是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮作用。下一步的工作將針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行研究分析，從機(jī)制上明確Treg在DC-CIK疫苗中的作用。

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