張 田 魏子峰 秦麗娟 周洪霞 張宇新

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北 唐山 063000)

目前，對帕金森病(PD)的治療仍然采用多巴胺(DA)替代療法，已知的藥物只能起到改善癥狀的作用，不能延緩疾病的進(jìn)程和DA能神經(jīng)元退變，而且長期服用會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，因此急需找到有效的治療藥物。近年研究顯示，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在PD病理過程中可能起了重要作用〔1，2〕。羅格列酮是一種常用的治療糖尿病藥物，文獻(xiàn)報道，在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中對神經(jīng)元有保護(hù)作用〔3〕。本實驗以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)制備小鼠模型，探討羅格列酮能否減少炎癥因子環(huán)氧合酶(COX)-2、前列腺素E2(PGE2)和凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表達(dá)，從而對DA能神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，以期為PD尋找新的可能治療途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 雄性健康C57BL/6N 小鼠45只，12～14 周齡，體質(zhì)量 25～30 g，清潔級，購于北京維通利華公司，自由進(jìn)食，飲水，室溫(25±2)℃，單籠喂養(yǎng)。MPTP(Sigma，USA)、兔抗人COX-2多克隆抗體(福州邁新公司)、兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(福州邁新公司)、兔抗鼠PGE2單克隆抗體(Cayman，USA)、預(yù)染蛋白Marker(天津灝洋生物公司)、大鼠抗酪酸羥化酶(TH)單克隆抗體(Chemicon，USA)、羅格列酮(英國葛蘭素史克公司)、UltraSensitive SP超敏試劑盒(福州邁新公司)。

1.2動物分組和模型制備 實驗動物隨機(jī)分為3組，每組15只。模型組：腹腔注射MPTP(25 mg/kg，生理鹽水溶解)，1次/d，連續(xù)7 d；羅格列酮處理組：在MPTP注射前4 h灌胃給予羅格列酮預(yù)處理(4 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d；對照組：注射與模型組等量生理鹽水。

1.3組織固定、取材和切片 MPTP第7 次注射后12 h ，每組隨機(jī)取9只小鼠。腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管用生理鹽水(室溫)灌注，再用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取中腦黑質(zhì)部位腦塊，置于4%多聚甲醛后固定48 h(4℃)，固定好的腦組織經(jīng)蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，包埋后，石蠟切片機(jī)做連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，4℃保存?zhèn)溆?。每組15只小鼠中，隨機(jī)取另外6只進(jìn)行免疫印跡分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)部分，置入細(xì)胞裂解液中，低溫勻漿，4℃震蕩30 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)顯色采用鏈霉素親生物素-過氧化酶連接法(SP)法，步驟如下：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)(pH 7.4±0.2)洗3次，每次5 min；組織切片進(jìn)行水浴法抗原修復(fù)；降至室溫；每張切片加入過氧化氫(25 μl)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；每張切片滴加10%正常山羊血清(25 μl)室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗人COX-2多克隆抗體(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠PGE2單克隆抗體(1∶300)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶300)，4℃過夜；加入二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶150)室溫孵育20 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(25 μl)室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。免疫組織化學(xué)顯色數(shù)據(jù)，采用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像自動分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。各組每只動物3張腦片數(shù)值相加后取平均值。

1.5免疫印跡 蛋白定量后取4倍體積樣品緩沖液，95°C變性10 min。蛋白上樣量為每孔30 g，10% SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，依分子量大小切取條帶，加入封閉液室溫下震蕩2 h后，取相應(yīng)條帶分別加入兔抗人COX-2多克隆抗體(1∶100)，兔抗鼠caspase-3多克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠PGE2單克隆抗體(1∶300)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶400)，4℃過夜。室溫孵育1 h后；分別加入二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶500)室溫孵育1 h；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h；DAB顯色,掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。

1.6行為學(xué)檢測 為了測定各組小鼠行為學(xué)功能改變，本實驗采用爬桿實驗。具體方法是，MPTP注射7 d后，將一根長55 cm直徑0.8 cm的木桿上端纏以紗布以防止打滑，作為實驗爬桿。測試時將被測小鼠頭向上置于木桿頂端。分別記錄小鼠轉(zhuǎn)身時間(T-turn)和完全爬到桿底所需要的時間(T-LA)并作統(tǒng)計學(xué)分析。每只小鼠測3次取平均值。爬桿時間參數(shù)的延長反應(yīng)小鼠運(yùn)動功能損害的程度。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)檢測 對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)偶見COX-2、PGE2和caspase-3陽性細(xì)胞， 模型組COX-2、PGE2和caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多；經(jīng)羅格列酮處理后，COX-2、PGE2和caspase-3陽性細(xì)胞較模型組降低(P<0.05)。對照組小鼠黑質(zhì)區(qū)可見大量TH陽性神經(jīng)元，與對照組比較，模型組TH陽性神經(jīng)元大量丟失，經(jīng)羅格列酮處理后，TH陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕(P<0.05)。見表1。

2.2免疫印跡檢測 免疫印跡結(jié)果顯示，對照組僅有微量COX-2、PGE2和caspase-3表達(dá)，模型組COX-2、PGE2和caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；經(jīng)羅格列酮處理后，COX-2、PGE2和caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；模型組TH表達(dá)較對照組降低，羅格列酮治療后出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠中腦黑質(zhì)COX-2，PGE2，caspase-3和TH陽性細(xì)胞數(shù)

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)COX-2，PGE2，caspase-3和TH蛋白表達(dá)水平

2.3行為學(xué)檢測 MPTP注射7 d后，模型組小鼠出現(xiàn)典型PD樣癥狀，表現(xiàn)為豎毛、翹尾、震顫和運(yùn)動變緩等特征。爬桿試驗中，與對照組小鼠比較，出現(xiàn)爬桿能力下降，爬桿所需用時間顯著延長。羅格列酮處理后，小鼠運(yùn)動功能得到一點程度改善，表現(xiàn)為爬桿時間明顯縮短(P<0.05)。見表3。

表3 羅格列酮對不同組小鼠爬桿時間的影響

3 討 論

PD是一種常見于中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，其病理改變主要為中腦黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元變性壞死，DA合成減少，進(jìn)而抑制乙酰膽堿的功能降低，兩者失衡從而出現(xiàn)“震顫麻痹”。迄今為止，病因及發(fā)病機(jī)制不詳。

研究表明，細(xì)胞凋亡是PD發(fā)病的重要機(jī)制之一〔4〕。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程的最終執(zhí)行者，在DA能神經(jīng)元變性中可能起重要作用〔5〕。COX-2是炎癥介質(zhì)PGE2合成的限速酶，有研究顯示，COX-2及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)PGE2可能參與DA能神經(jīng)元丟失〔6〕。本實驗采用MPTP制備PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天觀察了小鼠黑質(zhì)區(qū)COX-2、PGE2和凋亡因子caspase-3的表達(dá)及TH神經(jīng)元丟失情況。免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元顯著丟失，同時伴有COX-2、PGE2和caspase-3大量表達(dá)，而對照組未出現(xiàn)上述變化；免疫印跡檢測，結(jié)果也顯示了同樣的趨勢。這些現(xiàn)象表明，DA能神經(jīng)元丟失可能與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡存在密切聯(lián)系。

目前，對PD的治療仍然是控制癥狀，左旋多巴是治療PD的首選藥物，但它并不能阻止病程進(jìn)展，長期應(yīng)用會使疾病惡化。文獻(xiàn)報道，羅格列酮能減少脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)〔7〕，在亨廷頓疾病中，羅格列酮可防止線粒體功能障礙，對神經(jīng)元起到保護(hù)作用〔8〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，在MPTP所致PD慢性動物模型中，羅格列酮可以通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ表達(dá)水平從而抑制炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α產(chǎn)生〔9〕。由于MPTP選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)末梢DA遞質(zhì)大量減少，從而出現(xiàn)PD樣癥狀。

綜上，在本實驗條件下，MPTP可誘導(dǎo)模型動物中腦黑質(zhì)COX-2、PGE2和caspase-3的高表達(dá)，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性丟失；羅格列酮可抑制COX-2、PGE2和caspase-3表達(dá)，使DA能神經(jīng)元變性丟失現(xiàn)象有所減輕，從而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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