張曉艷 胡海燕 陳 翔 王文花

(溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，浙江 溫州 325003)

清心開竅方用于治療阿爾茨海默病(AD)療效顯著，尤其對(duì)早期出現(xiàn)癥狀者效果更佳，臨床治療AD能明顯改善患者的認(rèn)知功能障礙、行為和精神癥狀等〔1～3〕。前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該方水煎劑能明顯改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低AD小鼠腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量及乙酰膽堿酯酶(AchE)活性，降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用〔4～7〕。本研究從細(xì)胞水平探討清心開竅方含藥腦脊液對(duì)氯化鉀損傷所致神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及細(xì)胞株 SD大鼠60只，雄性，SPF級(jí)，體重(250±20)g，健康狀況良好，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004。PC12細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1.2藥材與試劑 清心開竅方(生地、麥冬、白芍、石斛、丹皮、茯神、苦參6 g、陳皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g)：湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供。氯化鉀：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。尼莫地平：山東新華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20100711。髙糖DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司提供。胎牛血清：Gibco公司提供。胰蛋白酶：上海生工提供。二甲基亞砜：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。MTT：美國(guó)Sigma公司提供。一步法RT-PCR試劑盒：寶生物工程有限公司提供。Trizol：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。100 bp標(biāo)準(zhǔn)DNA分子：美國(guó)Promega公司提供。焦碳酸二乙酯(DEPC)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。引物：上海生工生物工程公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)用主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋公司產(chǎn)品。倒置顯微鏡COVER-018：日本Olympus公司產(chǎn)品。WZ-ZA微量振蕩器：北京海淀電子醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。TGL16M臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品。XW-80A旋渦混合器：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠產(chǎn)品。電熱恒溫水浴箱(DZ-84)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。凈化工作臺(tái)：蘇州凈化儀器廠產(chǎn)品。酶標(biāo)儀、紫外分光光度儀、DNA熱循環(huán)擴(kuò)增儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。超低溫冰箱：青島海爾公司產(chǎn)品。凝膠掃描成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Startganee公司產(chǎn)品。

1.4含藥腦脊液的制備 SD大鼠20只，雄性，給藥組10只，灌胃給予清開方水煎液(7.9 g/kg)，2次/d，連續(xù)3.5 d?？瞻捉M為正常對(duì)照組，給予同體積(10 ml/kg)的生理鹽水。第7次給藥后1 h，以水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，頸后部備皮，75%酒精消毒，將大鼠頸部彎曲以暴露枕骨大孔，用1 ml無菌注射器，從枕骨大孔刺入延髓池，取50 μl腦脊液后迅速抽出針頭，合并腦脊液，4 ℃條件離心(3 000 r/min，10 min)，收集上清，過濾，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5PC12細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞接種于75 ml培養(yǎng)瓶，用含15%，53℃滅活胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素)，37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，加入0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×106/ml，接種于涂有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開始加藥。取長(zhǎng)滿單層PC12細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，用D-Hank液洗滌2次，加入無血清DMEM，細(xì)胞分為①正常組、②模型組、③尼莫地平組、④10%正常腦脊液組、⑤10%含藥腦脊液組、⑥20%正常腦脊液組、⑦20%含藥腦脊液組，4孔/組。①組加入無血清的DMEM，②～⑦組每孔加入終濃度800 mmol/L的氯化鉀造模，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，然后③組加入終濃度為1×107mol/L尼莫地平，④組、⑥組分別加入10%、20%正常腦脊液，⑤組和⑦組分別加入10%、20%的清開方含藥腦脊液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱作用4 h后，棄去培養(yǎng)液，用D-Hank液洗滌2次，加入無血清DMEM培養(yǎng)24 h，在造模過程中及造模后，③～⑦組均加入相應(yīng)濃度的藥物及腦脊液。

1.6MTT檢測(cè) 稱取MTT 0.5 g，溶于100 ml PBS中使其濃度為5 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃避光保存。將貼壁率約為80%的PC12細(xì)胞用吸管輕輕吹打調(diào)成細(xì)胞懸液，移至離心管500 r/min，離心5 min，棄上清，加入3 ml完全培養(yǎng)基重復(fù)洗一遍，加入完全培養(yǎng)基用吸管輕輕吹打調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞密度約0.5×106/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加入不同的造模藥物與相應(yīng)濃度的腦脊液，培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值并記錄。含藥腦脊液對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)率=(含藥腦脊液組OD570-空白腦脊液組OD570)/(正常組OD570-模型組OD570)×100%。

1.7RT-PCR檢測(cè)方法

1.7.1組織中總RNA的提取 取50 mg左右凍存組織標(biāo)本至勻漿器中加1 ml Trizol快速研磨。將勻漿液轉(zhuǎn)移到無菌、RNasse-free的1.5 ml離心管中，用吸頭反復(fù)吹打，振蕩后室溫靜置5 min。加人200 μl氯仿，振蕩混勻15 s，室溫靜置3 min，4℃，12 000 r/min離心15 min。將上清小心轉(zhuǎn)移到無菌、RNasse-free的1.5 ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，混勻，冰浴10 min。4℃，12 000 r/min離心15 min。棄上清，吸水紙控干液體，加人1 ml 75%冰乙醇DEPC水配制)，混勻。4 ℃，8 000 r/min離心5 min，棄上清，吸水紙控干。重復(fù)一次?？馗珊?，斜放室溫晾20 min，加人20～30 μl DEPC水，所得溶液即為RNA樣品，可立即使用或置-80℃冰箱保存。

1.7.2RNA的鑒定 ①RNA純度鑒定：取5 μl RNA溶液，加DEPC水稀釋至60 μl，以DEPC水作為空白對(duì)照，讀取紫外分光光度計(jì)260、280 nm波長(zhǎng)下的光密度值，計(jì)算其A260/A280的比值。②RNA濃度測(cè)定：取5 μl RNA溶液，加DEPC水稀釋至60 μl，槍頭混勻，以DEPC水作為空白對(duì)照，讀取紫外分光光度計(jì)260 nm波長(zhǎng)下的光密度值。③RNA完整性鑒定：應(yīng)用1%甲醛變性的瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性。④一步法RT-PCR擴(kuò)增：參照一步法RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。Bax(擴(kuò)增片段376 bp)：上游:5'- TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG -3'下游:5'- GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC -3'；BCl-2(擴(kuò)增片段236 bp)：上游:5'- GCATCTTCTCCTTCCAG -3'下游:5'- ATCCCAGCCTCCGTTAT -3'；半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3(擴(kuò)增片段420 bp)：上游:5'-GGTATTGAGACAGACAGTGG -3'下游:5'-CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3'；內(nèi)參β-actin(擴(kuò)增片段512 bp)：上游:5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'下游:5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'。

1.7.3RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及半定量分析 取6 μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，恒壓80 V，電泳1 h，紫外燈下分析PCR結(jié)果，并用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值，計(jì)算Bcl-2，Bax,Caspase-3/β-actin的比值，以獲得目的片段的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1PC12細(xì)胞活力比較 與正常組相比，模型組OD值明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，10%、20%正常腦脊液組OD值無顯著性差異(P>0.05)；尼莫地平組、10%、20%含藥腦脊液組OD值均明顯升高(P<0.01)；與尼莫地平組相比，10%、20%含藥腦脊液組OD值均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組PC12細(xì)胞活力比較

2.2PC12細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3、mRNA表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組Bax mRNA、Caspase mRNA表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，10%、20%正常腦脊液組Bax mRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)；尼莫地平組、10%、20%含藥腦脊液組Bax mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；與尼莫地平組相比，10%、20%含藥腦脊液組Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。見圖1，表2。

M：Marker；1：正常組；2：模型組；3：尼莫地平組；4：10%正常腦脊液組；5：10%含藥腦脊液組；6：20%正常腦脊液組；7：20%含藥腦脊液組

表2 PC12細(xì)胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

AD其首要癥狀是智力、記憶力、感官定向力、判斷力、語言思維能力不可逆的進(jìn)行性退化，并常伴有性格改變。PC12 細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細(xì)胞株，具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性，可傳代，已廣泛用作神經(jīng)細(xì)胞體外模型。MTT 測(cè)試通過測(cè)定細(xì)胞線粒體脫氫酶活性借以判斷活細(xì)胞數(shù)目，即OD值。OD值越大，表示存活的細(xì)胞數(shù)目越多，細(xì)胞損傷越小。

凋亡參與了AD神經(jīng)元的變性，它是由多基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，受促凋亡和抑凋亡基因的協(xié)同控制。目前已知有多種基因，如Bcl-2、Bax、P53、fas等〔8〕，特別是Bax和Bcl-2基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系更為密切〔9，10〕。Bcl-2和Bax作為一對(duì)關(guān)系密切的凋亡相關(guān)基因，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的控制中起重要作用。Bcl-2基因有促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的能力，其過度表達(dá)可特異性抑制細(xì)胞凋亡，Bax基因的過度表達(dá)能加速IL-3細(xì)胞株在細(xì)胞因子缺失時(shí)發(fā)生細(xì)胞凋亡，并對(duì)抗Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。一般認(rèn)為Bcl-2主要在凋亡上游事件中起保護(hù)作用，而Caspase-3主要在凋亡的下游事件中發(fā)揮促凋亡作用。最新研究證實(shí)了Caspase介導(dǎo)的APP切割產(chǎn)物與Aβ共定位于AD老年斑中?？梢奀aspase在調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性Aβ的生成及在AD神經(jīng)元最終的凋亡中有著極其重要的作用〔12〕。

本研究說明含藥腦脊液對(duì)KCL 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平調(diào)節(jié)Bcl-2 和Bax 的表達(dá)實(shí)現(xiàn),也證明了清心開竅方對(duì)PC12 細(xì)胞線粒體通路的凋亡具有抑制作用，這可能是該方抗老年性癡呆的機(jī)制之一。

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