李璐璐 于 丹 王 瑩 井 歡 劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110032)

肺癌常規(guī)應(yīng)用順鉑等化療藥物治療時(shí)，常由于順鉑耐藥而影響療效〔1〕。因此，研究肺癌耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)途徑對治療具有重要作用〔2〕。研究表明，補(bǔ)中益氣湯可對抗化療引起的胃腸道等不良反應(yīng)，改善肺癌耐藥，提高療效〔3〕。P-gp蛋白的過度表達(dá)是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的分子基礎(chǔ)，RNA干擾(RNAi)技術(shù)通過引起與其同源的mRNA特異性降解，達(dá)到抑制相應(yīng)基因表達(dá)的目的。本實(shí)驗(yàn)主要觀察補(bǔ)中益氣湯含藥血清對A549/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及P-gp表達(dá)的影響，探討該復(fù)方藥物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的有關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌耐順鉑A549/DDP細(xì)胞購自中國科學(xué)院腫瘤醫(yī)院中心細(xì)胞庫(北京)。SPF級SD 大鼠體重(200±20)g，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部提供(動(dòng)物許可證號:2012-0012號)。MTT、DMSO、RPMI1640培養(yǎng)基購于北京鼎國;胎牛血清購于Hyclone;兔抗人P-gp及β-actin購于南京凱基；siRNA由北京鼎國公司設(shè)計(jì)合成;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑均購于北京鼎國公司。電轉(zhuǎn)移儀購于美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計(jì)(Q-5000)購于Quwell公司，凝膠成像分析儀購于北京市六一儀器廠，雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR儀購于ABI公司。

1.2方法

1.2.1制備含藥血清 根據(jù)《藥典》中規(guī)定補(bǔ)中益氣湯的用藥劑量(黃芪18 g，甘草9 g，人參6 g，當(dāng)歸3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術(shù)9 g)，計(jì)算出大鼠等效劑量，以0.576 g/ml常規(guī)煎煮。大鼠灌胃給藥每日1次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后，動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，腹主動(dòng)脈采血，置無菌管，靜置30分后離心，取上清，56 ℃水浴滅活，于超凈臺上過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將A549/DDP細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清培養(yǎng)，放置在含5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中保存。細(xì)胞長滿貼壁后，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。含藥血清組在細(xì)胞生長至70%時(shí)更換含10%補(bǔ)中益氣湯含藥血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.3RNAi 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則及P-gp基因在GeneBank中的序列合成3對特異siRNA1、 siRNA2、siRNA3分別對應(yīng)P-gp mRNA的3個(gè)不同部位，用NCBI網(wǎng)站的BLAST序列進(jìn)行對比，排除同源性。P-gp1F：5′GATCC GCTGGTTGCTGCTTACATATTCAAGAGATATGTAAGCAGCAACCAGCTTTTTTA3′；P-gp1R：5′AGCTTAAAAAAGCTGGTTGCTGCTTACATATCTCTTG AATATGTAAGCAGCAACCAGCG3′；P-gp2F：5′GATCCGCTGCTTACATTCAGGTCATTCAAGAGATGACCTGAATGTAAGCAGCTTT TTTA3′；P-gp2R：5′AGCTTAAAAAAGCTGCTTACATTCAGGTCATCTCTTGAATGACCTGAATGTAAGCAGCG3′；P-gp3F：5′GATC CGGAGATAGGCTGGTGATGTTTCAAGAGAACATCACCAGCCTA TCTCCTTTTTTA3′；P-gp3R：5′AGCTTAAAAAAGGAGATAGGCTGGTGATGTTCTCTTGAAACATCACCAGCCTATCTCCG3′；0F：5′GATCCGCAGATAGGTAGGCGTTATTTCAAGAGAATAACGCCTA CCTATCTGCTTTTTTA3′；0R：5′AGCTTAAAAAAGCAGATAGGTAGGCGTTATTCTCTTGAAATAACGCCTACCTATCTGCG3′。

1.2.4RT-PCR 按照Trizol一步法分別提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增出P-gp、內(nèi)參GAPDH基因片段。P-gp：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'；β-actin：上游：5'CCACTCCTCCACCTTTGAC3'；下游：5'ACCCTGTTGCTGTAGCCA3'，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外透射儀上觀察結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參照，用反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的比值表示P-gp基因的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western 印跡) 分別將收集培養(yǎng)的3組細(xì)胞提取總蛋白，灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，在暗室用ECL發(fā)光，掃描圖像后，用Quantity One軟件測定各條帶的吸光度分析結(jié)果，采用所測的p-gp條帶與β-actin吸光度值的比值表示該蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.6免疫細(xì)胞化學(xué)法 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，接種于置有蓋玻片的24孔板中，實(shí)驗(yàn)分為A549/DDP空白血清組、補(bǔ)中益氣湯含藥血清組、siRNA處理組和陰性對照組。細(xì)胞貼壁后，A549/DDP空白血清組加入含有10%的空白血清的培養(yǎng)基，A549/DDP含藥血清組加入含有10%的中劑量補(bǔ)中益氣湯含藥血清作為培養(yǎng)基，siRNA處理組將細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，使用空白血清作為培養(yǎng)基，陰性對照組正常培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片,4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，山羊血清封閉30 min，滴加一抗4 ℃在濕盒中孵育過夜。生物素標(biāo)記二抗，作用30 min后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)處理后，封片。陰性對照以PBS代替一抗，余同上。用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行分析，以細(xì)胞質(zhì)/膜或核中出現(xiàn)粗細(xì)一致的棕黃色顆粒作為陽性，隨機(jī)取 5 個(gè)視野，在 400 倍高倍鏡下，計(jì)數(shù)細(xì)胞，測出陽性反應(yīng)細(xì)胞的總面積(Area)和吸光度(Absorbance)，求出平均光密度(AOD)。

1.2.7按試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將siRNA以200 mmol/L的終濃度接種于A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育48 h后，搜集細(xì)胞。取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，按照密度為1×105個(gè)/ml，接種96孔板，每孔加液量為200 μl。分設(shè)A549/DDP組、補(bǔ)中益氣湯含藥血清組和siRNA組，各組均取5種DDP質(zhì)量濃度:25、50、100、200、400 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入濃度為5 mg/ml的MTT，20 μl/孔，孵育4 h后，加二甲基亞砜(DMSO)，150 μl /孔，靜置10 min，于酶標(biāo)儀 570 nm 讀取吸光度值。根據(jù)公式：耐藥倍數(shù)RI=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50，計(jì)算出RI。

2 結(jié) 果

2.1Western 印跡 siRNA-P-gp作用后P-gp蛋白表達(dá)強(qiáng)度至(81.66±1.73)%(P<0.01)，補(bǔ)中益氣湯作用A549/DDP細(xì)胞后能夠降低其P-gp蛋白的表達(dá)強(qiáng)度至(85.29±2.36)%(P<0.01);與siRNA類似。見圖1。

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá) P-gp蛋白于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中表達(dá)較多，A549/DDP空白血清組中胞質(zhì)棕黃色，深染，有大量棕黃色顆粒，表達(dá)呈強(qiáng)陽性；A549/DDP含藥血清組同siRNA組僅局部細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，表達(dá)明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

1：A549/DDP空白對照組；2：陰性對照組；3：siRNA-處理組；4：補(bǔ)中益氣湯含藥血清組

A549/DDP空白對照組 siRNA-處理組

補(bǔ)中益氣湯含藥血清組 陰性對照組

2.3RT-PCR A549/DDP空白血清組mRNA表達(dá)為1，siRNA-P-gp作用后mRNA表達(dá)強(qiáng)度降至(32.32±0.59)%(P<0.05),補(bǔ)中益氣湯含藥血清作用A549/DDP細(xì)胞后能夠降低其P-gp mRNA的表達(dá)強(qiáng)度至(49.41±4.83)%(P<0.05)。

2.4對A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用 將3組細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，經(jīng)siRNA干擾P-gp mRNA及補(bǔ)中益氣湯含藥血清處理后，A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50顯著降低，A549/DDP組、siRNA組、補(bǔ)中益氣湯含藥血清組IC50值分別為(36.15±0.37)、(13.24±0.15)、(17.98±0.84)μmol/L，RI分別降至2.73和2.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，它的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多階段過程,與基因和多種分子水平變化有關(guān)，順鉑是目前臨床治療肺癌的基本藥物，肺癌細(xì)胞對 DDP 耐藥是化療失敗的重要原因之一〔4〕，研究表明，p-gp蛋白與該類藥物耐藥密切相關(guān)，其過度表達(dá)可明顯影響藥物的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和分布,從而導(dǎo)致靶點(diǎn)藥物有效濃度下降而介導(dǎo)耐藥〔5〕。siRNA是一種由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默過程，作為一種新的研究工具，這項(xiàng)技術(shù)是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，可消除或減少特異基因活性，導(dǎo)致相應(yīng)組織靶基因功能切除，從而產(chǎn)生靶定破壞基因的效果，特異性地抑制目的基因的表達(dá)〔6〕，具有高效性，穩(wěn)定性，高度序列特異性，操作簡單等特點(diǎn)〔7〕。本研究結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞經(jīng)過補(bǔ)中益氣湯含藥血清作用后能有效降低P-gp mRNA和蛋白的表達(dá)，提高對順鉑的化療敏感性，其機(jī)制可能與沉默P-gp后減低膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

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