王 理 文西年 文大成 依里牙爾·依里哈木 許新才 高 華 張文斌

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830000)

大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，肝臟是大腸癌最常見的轉移部位，已有研究認為結腸癌肝轉移涉及原位癌細胞血管侵入、肝血管內(nèi)皮細胞附著，以及肝實質(zhì)浸潤種植，從而導致肝轉移灶的形成。其可能機制包括黏附分子、血管新生因子、細胞外金屬基質(zhì)蛋白酶等多種基因表達異?！?〕。更加深入理解結腸癌肝轉移的病理分子機制以及尋求新的治療靶點，從而針對性開展臨床試驗是工作目標。本研究旨在建立一種新的結腸癌肝轉移的模型，并通過體內(nèi)及體外試驗篩選出侵襲能力高、轉移能力高的細胞株。

1 材料與方法

1.1試劑及器材 四甲基耦氮唑鹽(MTT)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；RPMI 1640(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。二氧化碳孵箱(美國NAPCO公司)；超凈工作臺；離心機；ELISA酶標儀(Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；細胞培養(yǎng)板(Millipore公司)；無菌濾器(美國Costar公司)；無菌手術器械。

1.2細胞系及動物 結腸癌HT29 細胞株購自中國科學院上海細胞研究所。6～8周齡的BALB/c小鼠，雄性，體重18～22 g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供〔實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2003-0001〕。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 解凍人結腸癌HT29 細胞株，用生理鹽水洗滌兩次，接種于含10%新生牛血清(56℃滅活30 min)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，酶消化備用。

1.3.2結腸癌高轉移細胞株的篩選 結腸癌HT29細胞懸液，用生理鹽水洗滌兩次，選用6～8周齡BALB/c小鼠，在腋側皮下接種前述細胞，待皮下瘤生長到約1.5 cm3處死小鼠,完整剝離皮下轉移瘤組織作為移植源材，重復3次，最后得到的皮下移植瘤細胞即為高轉移、高侵襲性結腸癌細胞。

1.3.3建立高轉移、高侵襲性結腸癌肝轉移的動物模型 6～8周齡的BALB/c小鼠，取腹部正中切口,長約10～15 mm,充分暴露盲腸后，用無齒鑷將損傷腸管向內(nèi)推壓，使局部腸壁形成凹陷，取上述皮下移植所得腫瘤組織塊置于漿膜與漿膜下層，使用醫(yī)用膠固定于腸壁,關閉腹腔。術后繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境下建立高侵襲性結腸癌肝轉移的模型。

1.3.4提取RNA及擴增 用冰冷PBS液洗滌細胞兩次，Trizol一步法提取總RNA，加入Takara公司Trizol 試劑1 ml，靜置15 min，小滴管吹打使細胞完全裂解，移入1.5 ml EP管內(nèi)，再入200 μl氯仿，劇烈震蕩混勻30 s，靜置10 min，分層，上層水相，下層酚相。而后4℃15 000 r/min離心15 min后，上層為水相。將上層液體移入另一新EP管內(nèi)，約400～500 μl，新EP管內(nèi)加入等量異丙醇溶液，充分混勻，靜置10 min后4℃ 15 000 r/min離心10 min，管底可見RNA沉淀。棄上清，留RNA沉淀，加入4℃ 75%乙醇漂洗兩次，吸干液體后干燥約20 min，待沉淀為半透明狀時，用20 μl DEPC水溶解RNA沉淀。紫外分光光度計檢測RNA產(chǎn)物濃度和純度。非變性電泳A260/A280判斷RNA的純度和完整性以滿足后續(xù)實驗要求。而后用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) 試劑盒合成cDNA。

1.3.5cDNA芯片 采用RNA Fluorescence Labeling Core Kit(M-MLV Version，Takara) 芯片技術〔2〕。10 μl逆轉錄體系中加入4 μg細胞總RNA，Cy3/Cy5-dUTP法分別標記親代細胞和高轉移細胞的RNA，純化后乙醇沉淀，將標記探針混合溶解到10 μl雜交液中(含有50%甲酰胺，50 mmol/L DTT，5×Denhardt液，5%硫酸葡聚糖，4×SSC，0.2%SDS)。用人癌基因芯片〔Human Cancer Chipversion 4.0 (Takara，Japan)〕做cDNA雜交。95℃2 min將探針變性，后放冰上，完全冷卻后15 000 r/min離心10 min取上清液置芯片上，覆蓋玻片后置于雜交艙65℃ 16 h。洗滌依次為：4×SSC/0.2%SDS溶液55℃30 min×2次；2×SSC/0.2%SDS溶液65℃5 min×1次；0.05×SSC室溫5 min×1次。基因芯片放入50 ml離心管3 000 r/min離心2 min，將其表面水分甩干。用Agilent掃描儀掃描，用Imagene3.0軟件(Biodiscovery,Inc.)圖像分析。計算2種熒光Cy3/Cy5信號強度的比值。定義高轉移性相關基因標準：①上調(diào)基因：高轉移性組Cy3/ Cy5>2.0，Cy5>500，且與親代組細胞差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②下調(diào)基因：高轉移性組Cy3/Cy5 <0.5，Cy3>500，且與親代組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1.3.6實時熒光定量PCR鑒定 基因引物序列見表1。采用StepOne PCR儀和TaqMan SYBR Green I(Takara)進行熒光定量檢測。在差異表達基因中選擇6個基因進行定量驗證，3個上調(diào)基因，3個下調(diào)基因， GAPDH設為內(nèi)參。20 μl qPCR反應體系(TaqMan SYBR Green I，Takara公司試劑)。每樣品設三副孔，每次實驗均設空白孔和陰性對照孔。

表1 7個基因的引物序列

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1差異表達基因結果 高轉移性組與親代組相比共36個基因差異表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，其中表達上調(diào)基因有20個，表達下調(diào)的基因有16個。兩組間表達差異有統(tǒng)計學意義的基因的Cy3/Cy5比值波動于0.25～3.16。跟據(jù)差異表達基因的生物學功能進行分類，見表2。

表2 差異表達基因

2.2實時熒光定量PCR結果 利用實時熒光定量PCR技術驗證了3個上調(diào)和3個下調(diào)表達基因，顯示基因芯片和實時熒光定量PCR兩種檢測技術對于檢測mRNA表達可信度均較好，變化方向一致。見圖1。

圖1 qPCR驗證6個差異基因的表達

3 討 論

惡性腫瘤細胞具有遷移、侵襲和血管生成的生物學特性，這些生物學特性是腫瘤基因改變和環(huán)境異常共同作用的結果。本研究將結腸癌HT29 細胞株進行體內(nèi)連續(xù)傳代，獲得高轉移結腸癌細胞株，并建立了高侵襲性結腸癌肝轉移的動物模型；同時利用cDNA-microarray技術篩選出結腸癌高轉移性相關基因，結果顯示，親代組與高轉移組之間有36個基因表達差異。

惡性腫瘤細胞高轉移生物學特性機制涉及腫瘤細胞由原發(fā)病灶脫落、轉移遷移、基底膜破壞、浸潤、侵犯血管等過程〔3〕。本文結果顯示上調(diào)表達的基因中牽涉到粘連相關蛋白基因。MMP2和MMP9為MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)家族成員，能夠降解細胞外基質(zhì)(ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲生物學行為中發(fā)揮關鍵的作用〔4〕。我們篩選出的差異基因顯示高轉移性結腸癌可能存在生長因子信號通路異常高表達。以往研究表明酪氨酸激酶受體過度激活與腫瘤有良好的相關性。EPHB3是酪氨酸激酶受體Eph家族成員，可與ephrins結合相互作用參與腫瘤細胞遷移〔5〕。研究表明在非小細胞肺癌細胞系中高表達EPHB3能夠促進細胞的生長和遷移，而干擾EPHB3表達可顯著抑制腫瘤細胞生長、遷移以及在體內(nèi)的成瘤和轉移能力〔5〕。本文結果顯示EPHB3高表達與結腸癌的高轉移性有關。高轉移性結腸癌組中PTPN11和PTP1B基因較低表達也從另一方面說明了酪氨酸磷酸酶與腫瘤細胞高轉移生物特性相關〔6〕。PTPN11和PTP1B均為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，能夠通過調(diào)節(jié)細胞酪氨酸激酶磷酸化水平從而調(diào)節(jié)細胞生長、分化、遷移、轉錄和凋亡等；并且還與細胞免疫調(diào)節(jié)相關，該類酶活性的降低會導致細胞表面抗原低表達，從而使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃脫。

細胞周期調(diào)控在高轉移性結腸癌發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，而細胞周期的關鍵是G1期的啟動。Cyclin D1(CCND1)是調(diào)控細胞周期的基因，在G1期合成，并與CDKs蛋白家族成員形成復合物從而參與細胞周期控制。近來也發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白在結腸癌中過度表達可能是該腫瘤進展中的重要事件，還可能是獨立的預后因素〔7〕。細胞凋亡和細胞周期調(diào)控失衡共同作用可能是腫瘤細胞高轉移性的重要機制，但是其中確切的機制需要深入研究。

本文結果也表明細胞黏附分子異常表達可能參與高轉移性結腸癌發(fā)展，其中E-cadherin在高轉移性組中低表達。E-cadherin是細胞膜表面分子，介導上皮細胞-細胞間的黏附，這個結果似乎與之前其他的黏附分子表達不相一致，考慮到腫瘤細胞從原病灶脫落遷移至轉移部位再生長后重新表達黏附分子，可能發(fā)揮了在原發(fā)病灶中不同生物學作用〔8〕。新近也發(fā)現(xiàn)CD82基因是腫瘤轉移抑制基因，它的正常表達能夠抑制腫瘤的轉移能力〔9〕。在結腸癌高轉移組中CD82基因表達水平較親代組低，這樣可能更有利于結腸癌細胞高轉移生物學行為，其中機制需深入探討。

4 參考文獻

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6Bae HJ,Song JH,Noh JH,etal.Low frequency mutation of the Ephrin receptor A3gene in hepatocellular carcinoma〔J〕.Neoplasma,2009；25(21): 2987-98.

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8Saito T,Masuda N,Miyazaki T,etal.Expression of EphA2 and E-cadherin in colorectal cancer: correlation with cancer metastasis. Oncology Reports.2004.p38MAPkinase-mediated matrix metalloproteinase type 2 activation and cell invasion in human prostate cancer〔J〕. Oncogene,2006；23(4)：324-8.

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