王 旭 高素杰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室，遼寧 沈陽 110847)

近年流行病學(xué)資料顯示，與正常人群相比，阿爾茨海默病(AD)患者腦脊液中胰島素水平明顯下降，并伴有腦內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙〔1〕。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中胰島素基因表達(dá)減少, 提示腦中胰島素的含量減低可能與AD發(fā)病有直接關(guān)系〔2，3〕。但關(guān)于腦內(nèi)胰島素的缺乏加重AD的發(fā)病和發(fā)展的機(jī)制尚不明確。本研究將采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)注射STZ制備胰島素缺乏合并AD的動(dòng)物模型，觀察腦組織內(nèi)tau蛋白磷酸化改變。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取3月齡健康雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠16只，分為兩組，每組8只，其中一組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ) (Sigma公司)，使用前0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液新鮮配置，劑量為90 mg/kg，連續(xù)2 d。另一組作為對照組，注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。7 d后自尾靜脈采血，用便攜式血糖測定儀 (美國，強(qiáng)生) 測定血糖水平，隨機(jī)血糖持續(xù)大于15 mmol/L者符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，表明造模成功。動(dòng)物精心飼養(yǎng)20 w，每周監(jiān)測體重和血糖的變化。

1.2小鼠腦組織取材 動(dòng)物飼養(yǎng)第20周，各組小鼠麻醉后斷頭，迅速取出大腦放冰盤上，從中間矢狀縫切開，一半放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色；另一半-80 ℃保存?zhèn)溆?，供Western 印跡使用。

1.3Western 印跡 取APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層，按1∶5比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃ 12 000 r/min低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。按50 μg蛋白上樣，用10%聚丙烯酰胺分離膠，將蛋白質(zhì)提取物分離，再將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉 1 h后，分別加入鼠抗phosph-tau (Thr231) 抗體 (Invitrogen公司), 兔抗phosph-tau (Thr205) 抗體、兔抗phosph-tau (Ser396)，兔抗tau (Abcam公司) 4 ℃過夜。TBST洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊/鼠抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，ECL顯色，圖像分析。

1.4免疫組化染色 石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟至水，以3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS液沖洗后，檸檬酸/鹽緩沖液中微波修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉液室溫孵育30 min，甩去多余液體，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗phospho-tau (Thr489) 抗體 (Beijing Boisynthesis Biotechnology)，4 ℃過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察。以上各步驟均用PBS液沖洗，同時(shí)另用PBS代替一抗作為陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1Western 印跡法檢測p-tau和tau的表達(dá) Western印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測三個(gè)位點(diǎn)tau蛋白 (Thr205、Thr231和Ser396) 的表達(dá) (圖1)，結(jié)果顯示：在Thr205位點(diǎn)上兩組實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平比較無顯著性差異(0.358±0.047 vs 0.411±0.036,P>0.05)；與對照組比較，STZ組tau蛋白在位點(diǎn)Thr231(0.622±0.083 vs 1.178±0.092)和Ser396(0.449±0.068 vs 1.304±0.108)上的磷酸化程度顯著增高(P<0.01)；兩組實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)總tau蛋白的表達(dá)增高無顯著差異(0.590±0.068 vs 0.645±0.071，P>0.05)。

圖1 STZ致APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)多位點(diǎn)tau蛋白過度磷酸化

2.2免疫組化檢測p-tau的表達(dá) 在STZ組皮層神經(jīng)元的核周區(qū)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的棕黃色p-tau陽性表達(dá)顆粒，在同一區(qū)域內(nèi)對照組胞質(zhì)中僅見極少量棕黃色顆粒。STZ組p-tau陽性細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度高于對照組(0.036±0.006 vs 0.109±0.012，P<0.05)。見圖2。

對照組 STZ組

3 討 論

AD的主要病理特征是腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑 (SP) 和神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFTs)。胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，其主要功能是降低血糖。研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)存在胰島素和胰島素受體 (IR)。腦內(nèi)的胰島素可以由外周血中胰島素通過血腦屏障入腦，同時(shí)腦內(nèi)的部分神經(jīng)元也能夠合成和分泌胰島素〔4,5〕。近年來，大量流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)腦中胰島素的含量減低可能與AD發(fā)病有直接關(guān)系〔2,3〕，給予胰島素治療可使AD癥狀減輕〔6〕。本實(shí)驗(yàn)前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰島素缺乏可使APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的AD癥狀加重，其機(jī)制是通過增強(qiáng)了APP向淀粉樣斑塊沉積形成通路的代謝，從而使Aβ的分泌大大增多〔7〕。但胰島素缺乏是否也能引起tau蛋白過度磷酸化從而使AD癥狀加重的研究并未進(jìn)行，而且國內(nèi)尚未見報(bào)道。

Tau蛋白是一種重要的小分子微管相關(guān)蛋白，其作用為促進(jìn)微管組裝和穩(wěn)定微管，其促微管活性與磷酸化狀態(tài)密切相關(guān)，過度磷酸化的tau蛋白是NFTs的主要組成部分，是AD病理改變中重要的標(biāo)記性蛋白，與AD的發(fā)病有著不可分割的聯(lián)系〔8〕。有研究表明胰島素的功能障礙與tau蛋白的異常磷酸化有著密切的關(guān)系。Freude等〔9〕通過注射胰島素使外周血液中胰島素濃度增高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)tau蛋白Ser202位點(diǎn)磷酸化。另外，這項(xiàng)研究也報(bào)道了在胰島素受體缺乏的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，由于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生障礙從而導(dǎo)致腦內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化。Clodfelder-Miller等〔10〕研究也發(fā)現(xiàn)，向小鼠腹腔內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素缺乏可導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)的tau蛋白過度磷酸化。

本研究研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在STZ組的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)所檢測的Thr231、Ser396位點(diǎn)tau蛋白發(fā)生過度磷酸化改變。胰島素缺乏能導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化，從而加重AD發(fā)病。

4 參考文獻(xiàn)

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9Freude S,Plum L,Schnitker J,etal.Peripheral hyperinsulinemia promotes tauphosphorylation in vivo〔J〕.Diabetes,2005;54(12):3343-8.

10Clodfelder-Miller BJ,Zmijewska AA,Johnson GV,etal.Tau is hyperphosphorylated at multiple site in mouse brain in vivo after streptozotocin induced insulin deficiency〔J〕.Diabetes,2006;55(12):3320-5.