王 蓓 邢邯英 李建立 褚兆蘋 賈利剛 秦 英

(河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因及其他多種因素的共同參與，是細胞增殖與凋亡機制紊亂的結(jié)果。抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡在腫瘤的預(yù)防和治療過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，越來越多的研究表明，非甾體類抗炎藥物阿司匹林能夠通過抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡而降低胃癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生，對腫瘤具有一定的預(yù)防和治療作用〔1，2〕。本研究探討阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞增殖及凋的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人宮頸癌Hela細胞(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心)；阿司匹林(Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；小牛血清、胰酶DMSO等(Gibco公司)；鼠抗人Bcl-2、抗人Bax和羊抗鼠IgG-HRP二抗(Santa Cruz生物工程公司)；Hochest33258(美國Sigma-Aldrich 公司)；WST-1(瑞士 Roche 公司)。

1.2細胞常規(guī)培養(yǎng) 接種宮頸癌Hela細胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長約90% 融合時，以0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次。

1.3分組 實驗分為對照組和阿司匹林干預(yù)組。①對照組：取對數(shù)生長期的Hela細胞以5×105/瓶的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后更換含1% 乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；②阿司匹林干預(yù)組：細胞接種24 h后更換含有阿司匹林濃度分別為1.0、5.0、10.0 mmol/L 的RPMI-1640培養(yǎng)基(阿司匹林純品溶于無水乙醇中，過濾除菌，再用RPMI-1640培養(yǎng)基分別配置成終濃度為1、5、10 mmol/L，無水乙醇最大濃度為1%)，再置于37℃，CO2含量5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中48 h。

1.4細胞增殖檢測

1.4.1顯微鏡觀察 接種對數(shù)生長期的Hela細胞到6孔板，每孔1×105個，培養(yǎng)24 h后，以不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)處理細胞48 h，鏡下觀察其生長狀況。

1.4.2水溶性四氮唑(WST-1) 檢測 取對數(shù)生長期的Hela細胞接種到 96 孔板 ，每孔0.1×104個，接種細胞24 h后加入不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)，分別于作用后24、48、72 h每孔加入10 μl細胞增殖試劑WST-1，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后用酶標儀檢測 450 nm 波長各孔的光密度值(D450)，每組設(shè)立 3 個復(fù)合孔。 計算增殖抑制率。 增殖抑制率(%)= 〔1-觀察組D450值/對照組D450值〕×100%。

1.5細胞凋亡檢測

1.5.1Hochest 33258染色 不同濃度的阿司匹林(1.0、5.0、10.0 mmol/L)處理Hela細胞48 h后吸盡培養(yǎng)液，加入固定液，用PBS洗2遍。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2TUNEL染色 接種1×105個細胞于6孔板中，培養(yǎng)過夜后用設(shè)定濃度的 阿司匹林處理細胞48 h收獲細胞。4%多聚甲醛液固定30 min，過氧化氫孵育、牛血清白蛋白封閉、抗體孵育、SABC法染色，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察、計數(shù)、拍照。

1.6Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 細胞經(jīng)藥物處理后24、48 h,收集細胞加入細胞裂解液,冰上放置30 min,10 000 r/min離心1 min,保留上清,考馬斯亮藍染色酶標儀測定蛋白含量,加入上樣Buffer沸水中水浴5 min使得蛋白變性,在10% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離蛋白,再將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜,分別加鼠抗人Bcl-2、抗人Bax抗體一抗作用后,羊抗鼠IgG-HRP反應(yīng)2 h,TBST洗滌2遍,ECL顯影壓膠片。

2 結(jié) 果

2.1細胞增殖情況 顯微鏡觀察：與對照組相比，處理48 h后，阿司匹林濃度在1 mmol/L時，腫瘤細胞生長速度變慢；5 mmol/L時，可以看到大量變圓的凋亡細胞；10 mmol/L時，幾乎看不到貼壁的完整細胞(圖1)。WST-1檢測：與對照組相比，處理24 h，高劑量組(10 mmol/L)細胞數(shù)目明顯減少；處理48～72 h 后，中劑量組(5 mmol/L)對細胞的生長已有明顯抑制作用，高劑量組(10 mmol/L)細胞出現(xiàn)凋亡，少見存活細胞(見表1)。

2.2Hochest 33258染色鏡下觀察凋亡現(xiàn)象 見圖2。阿司匹林作用于細胞48 h后，各劑量組均出現(xiàn)凋亡征象，表現(xiàn)為細胞核內(nèi)可見濃染致密的藍色熒光顆粒及明顯核形態(tài)變化，并且隨著阿司匹林濃度的增高凋亡現(xiàn)象越明顯。

對照組

1 mmol/L

5 mmol/L

10 mmol/L

對照組 1 mmol/L 5 mmol/L 10 mmol/L

2.3TUNEL染色鏡下觀察凋亡現(xiàn)象 細胞經(jīng)不同濃度阿司匹林作用48 h后，TUNEL法檢測結(jié)果顯示不同濃度的阿司匹林可誘導(dǎo)細胞均發(fā)生凋亡，其表現(xiàn)為TUNEL染色陽性，即細胞核被染成顏色深淺不同的棕黃色，并且隨著劑量的增加效應(yīng)越明顯，見圖3。

表1 WST-1測定阿司匹林劑量和時間依賴性抑制Hela細胞的增殖

對照組

1 mmol/L

5 mmol/L

10 mmol/L

2.4Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 不同濃度阿司匹林作用24 h后,Hela細胞抑凋亡基因Bcl-2蛋白表達減少,促凋亡基因Bax蛋白表達增加,作用48 h后Bcl-2蛋白表達明顯減少,Bax蛋白表達顯著增加(見圖4)。

圖4 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

近年來人們發(fā)現(xiàn)阿司匹林等具有防治腫瘤的作用，其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的相關(guān)機制主要分為依賴于環(huán)氧化酶(COX)-2 途徑和非COX-2 途徑兩大方面〔3〕。研究認為，COX-2 的活性增高可以引起前列腺素 E2(PGE2)和Bcl-2 的高度表達，降低 E-鈣黏蛋白的活性而抑制細胞凋亡、刺激血管生成，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并增加惡性腫瘤的侵襲力〔4〕。而阿司匹林可通過抑制環(huán)氧化酶使花生四烯酸至前列腺素的代謝通路受阻，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到化學(xué)預(yù)防和治療的作用〔5〕。在非 COX-2 的途徑中，研究表明，阿司匹林可通過調(diào)節(jié) B 細胞淋巴瘤/白血病(BCL) 家族，C-myc，P 53，Caspase 等癌基因和抑癌基因〔6〕，影響細胞凋亡信號的傳導(dǎo)而抑制腫瘤細胞的生長，促進其發(fā)生凋亡。

Donowitz等〔7〕首次報道了長期服用阿司匹林的人群較普通人群結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯降低，此后數(shù)項流行病學(xué)調(diào)查、動物實驗和體外實驗都得出了類似的結(jié)論。Moysich等〔8〕通過臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，規(guī)律服用阿司匹林可有效降低肥胖婦女子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率，Kutuk等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠以劑量依賴的方式抑制體外子宮內(nèi)膜腺癌細胞株Ishikawa的生長，細胞凋亡是這些變化的機制之一。細胞凋亡已經(jīng)成為重要的生物學(xué)事件，也是抗腫瘤治療的一大研究熱點和新靶向〔10〕。此外，近年來許多文獻報道，DNA損傷因子包括化療藥物和放療等，在損傷DNA的同時還可以引起腫瘤細胞在G2/M期阻滯，甚至誘導(dǎo)細胞凋亡〔11〕。

本研究結(jié)果顯示，一定濃度的阿司匹林可以抑制人宮頸癌細胞株Hela增殖，并隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用也逐漸增強；且通過凋亡特異性細胞核染色等檢測證實，阿司匹林在抑制人宮頸癌細胞增殖的同時還誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果提示，阿司匹林能有效抑制宮頸癌細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，有望成為臨床上治療惡性腫瘤的重要手段。

綜上所述，阿司匹林處理宮頸癌Hela細胞后,可以影響B(tài)cl-2基因家族的調(diào)控,上調(diào)促進凋亡的Bax基因表達同時下調(diào)抑制凋亡Bcl-2基因,使得線粒體參與的凋亡途徑被活化,最終激活細胞凋亡過程中最重要的終末執(zhí)行酶Caspase-3,引起細胞凋亡〔12〕，可能為阿司匹林誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的主要機制。

4 參考文獻

1Leung AM,Redlak MJ,Miller TA.Aspirin-induced mucosal cell death in human gastric cells:role of a caspase-independent mechanism〔J〕.Dig Dis Sci,2009;54(1):28-5.

2Xiang S,Sun Z,He Q,etal.Aspirin inhibits ErbB2 to induce apoptosis in cervical cancer cells〔J〕.Med Oncol,2010;27(2):379-87.

3Lee SK,Park MS,Nam MJ.Aspirin has antitumor effects via expression of calpain gene in cervical cancer cells〔J〕.J Oncol,2008(2);2008:285-374.

4Kutuk O,Basaga H.Aspirin inhibits TNFα- and IL-1-induced NF-κB activation and sensitizes Hela cells to apoptosis〔J〕.Cytokine,2004;25(2):229-37.

5Kutuk O,Basaga H.Aspirin prevents apoptosis and NF-κB activationinduced by H2O2in Hela cells〔J〕.Talor﹠Francis healthsciences,2003;12(10):1267-76.

6Rajnish A.Cyclooxygenase-1 is overexpressed and promotes angiogenic growth factor production in ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2003;63(3):906-11.

7Donowitz M,Pauker SG.Evaluation for colon cancer in patients with occult fecal blood loss while taking aspirin:a Bayesian viewpoint〔J〕.Med Decis Making,1982;2(2):147-60.

8Moysich KB,Baker JA,Rodabaugh KJ,etal.Regular analgesic use and risk of endometrial cancer〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005;14(12):2923-8.

9Hector A,Arango MD.Aspirin effects on endometrial cancer cell growth〔J〕.Obstet Gynecol,2001;97(3):423-7.

10Morré DJ,Morre DM.tNOX,an alternative target to COX-2 to explain the anticancer activities of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDS) 〔J〕.Mol Cell Biochem,2006;283(1-2):159-67.

11朱慧明，吳 鐵，崔 燎.阿司匹林誘導(dǎo)人肺腺癌細胞株SPC-1凋亡研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2004；20(6)：640-3.

12Kim KY,Seol JY,Jeon GA,etal.The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl-2 and caspase-3 in human cervical cancer cell〔J〕.Cancer Lett,2003;89(2):157-66.